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引言
自然殺傷（NK）細胞在識別和殺死腫瘤和病毒感染的先天免疫和后天免疫反應中扮演著關鍵的角色。因此，已有許多研究嘗試研發(fā)在體外激活和擴增NK細胞的方法，以用于和免疫細胞相關研究，而目前的方法包括使用細胞因子、誘導因子以及飼養(yǎng)細胞1，其中細胞因子在調(diào)節(jié)NK細胞的活性中具有核心作用。據(jù)報道，IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和IFN-γ被歸類為NK細胞的細胞毒性 和增殖的活化細胞因子，能夠增強NK細胞對各種腫瘤的細胞毒性作用2。然而，這些激活NK細胞的細胞因子組合仍需研究人員進一步優(yōu)化。 康寧NK無血清培養(yǎng)試劑盒II中含有1瓶1 mL的包被培養(yǎng)基，1瓶50 mL的激活培養(yǎng)基，1瓶1,000 mL的擴增培養(yǎng)基和1個透氣性細胞培養(yǎng)袋。前兩個試劑專用于NK細胞的初期激活培養(yǎng)，擴增培養(yǎng)基和細胞培養(yǎng)袋則用于NK細胞后期擴增培養(yǎng)。NK激活培養(yǎng)基和擴增培養(yǎng)基均采用優(yōu)質(zhì)的試劑和符合目前的良好生產(chǎn)規(guī)范（cGMP）要求的原料制造。培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)是可注射等級的血清白蛋白和重組人胰島素。
NK培養(yǎng)試劑盒組分的應用概述
激活培養(yǎng)基：NKCC-1＋10%自體血漿（滅活） 擴增培養(yǎng)基：NKCC-2或NKCC-2＋5%自體血漿（滅活） 激活培養(yǎng)瓶：T-75培養(yǎng)瓶 （自備）+NKCC-3包被培養(yǎng)基 擴增培養(yǎng)瓶：可透氣細胞培養(yǎng)袋或T-225培養(yǎng)瓶 （自備）
試劑和材料
淋巴細胞分離液（LSM，康寧目錄編號：25-072-Cl） 不含鈣和鎂的磷酸鹽緩沖鹽（PBS），1×（500 mL）（康寧目錄編號：21-040-CV） T-75培養(yǎng)瓶（康寧目錄編號：353024） T-225培養(yǎng)瓶（康寧目錄編號：431082）
NK細胞的激活和擴增
包被T-75培養(yǎng)瓶（開始細胞培養(yǎng)的前1天） 1. 向15 mL離心管中加入13 mL的PBS及1 mL的NKCC-3用來制備包被培養(yǎng)基。 2. 將所有的包被培養(yǎng)基（14 mL）轉(zhuǎn)移至T-75培養(yǎng)瓶中。 3. 將預包被的培養(yǎng)瓶在37℃下孵育4小時或置于冰箱（2-8℃）中隔夜孵育。 4. 使用T-75培養(yǎng)瓶前先使用移液槍棄掉包被培養(yǎng)基，再用PBS潤洗兩次。 5. 將T-75培養(yǎng)瓶置于室溫下風干15分鐘。
制備PBMC（第1天） 1. 將經(jīng)抗凝處理的血液在室溫下以400 ×g離心10分鐘后，將血漿（上清液層）轉(zhuǎn)移到新的離心管中。 2. 將自體血漿在56℃下加熱滅活30分鐘后于800 ×g下離心20分鐘以去除沉淀物，將上清液血漿儲存于4℃下，存儲的自體血漿在接下來10天的細胞培養(yǎng)中使用。 3. 在血液樣本中加入等體積的PBS作為已被丟棄的自體血漿的代替品用以維持細胞懸浮液的體積， 然后輕輕地重懸血液。 注意：在PBS中預先添加0.1％人血清白蛋白（HSA）有助于維持血細胞的活力。 4. 根據(jù)說明書使用淋巴細胞分離液（LSM）將外周血單個核細胞（PBMC）從上述血液樣本中分離。注意：需采用新鮮的人體血液（收集后2小時內(nèi)）以獲得具更好的活性;請勿使用超過24小時抽取的血液。 5. 將PBMCs用含至少5xPBS（不含鈣和鎂）的體積洗滌后，在室溫下于500 ×g離心10分鐘，收集PBMCs。 注意：使用LSM可從1 mL的新鮮外周血中提取1x106個細胞；本NK細胞培養(yǎng)流程需要30 mL的外周血。
NK細胞的激活培養(yǎng)（第1-7天） 1. 在實驗第1天向30 mL的NKCC-1培養(yǎng)基中加入自體血漿至最終濃度為10％，以制備激活培養(yǎng)基。 2. 將PBMCs懸浮于20 mL的激活培養(yǎng)基（含10％自體血漿的NKCC-1培養(yǎng)基）中，并將細胞密度調(diào)整為1×106個細胞/mL。 3. 將20 mL的PBMCs懸液轉(zhuǎn)移至預先包被的T-75培養(yǎng)瓶后，放置在5% CO2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天。 4. 第3天或第4天根據(jù)PBMCs的細胞狀態(tài)來添加10 mL的激活培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)2天。 5. 在第6天將所有（30 mL）的PBMCs懸液收集到50 mL的離心管中，并在800 xg下離心5分鐘。 6. 吸除上清液后向細胞培養(yǎng)袋中加入適量（例如130 mL）的含5％自體血漿的NKCC-2培養(yǎng)基， 并將細胞密度調(diào)整為5×105個細胞/mL后進行孵育培養(yǎng)。 注意：若加入的培養(yǎng)基體積小于100 mL，則將細胞培養(yǎng)于在T-75培養(yǎng)瓶中；若加入的培養(yǎng)基體積超過100 mL，則需將細胞轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)袋或T-225培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
NK細胞的擴增培養(yǎng)（第8-11天） 1. 每2到3天檢測細胞的密度及活率，并根據(jù)細胞增殖狀態(tài)加入新鮮的NKCC-2培養(yǎng)基，將細胞密度維持在5×105個細胞/mL的水平。 注意：建議在NK細胞擴增期間添加的新鮮培養(yǎng)基中補充0.5％至1％的自體血漿，直至其耗盡為止。 2. 第11天將NK細胞收集后進行細胞計數(shù)和流式細胞分析。 注意：若后續(xù)實驗需要更高的細胞數(shù)量，可添加新鮮的581淋巴細胞無血清培養(yǎng)基（康寧目錄編號:88-581-CM）來延長細胞的培養(yǎng)期。
參考文獻
1. Zhang C, Zhang J, Niu J, Zhou Z, Zhang J, Tian Z. Interleukin-12 improves cytotoxicity of natural killer cells via upregulated expression of NKG2D. Hum Immunol 2008; 69:490-500. 2.Zhang C, Zhang J, Sun R, Feng J, Wei H, Tian Z. Opposing effect of IFN gamma and IFN alpha on expression of NKG2 receptors: negative regulation of IFN gamma on NK cells. Int Immunopharmacol 2005; 5:1057-67.
北京畢特博生物技術(shù)有限責任公司
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