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 快速操作指南

注意事項(xiàng) 請務(wù)必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項(xiàng)

1.使用前檢查 Pre-Wash Buffer及Lysis Buffer F1 是否有沉淀，若有請?jiān)?5 ?C加熱至完全溶解后使用。

2.Binding Buffer FS 使用前加入35 mL異丙醇（試用裝加3.5 mL），并在標(biāo)簽上做標(biāo)記。

3.Wash Buffer FS1 使用前加入21 mL乙醇（試用裝加2.1 mL），并在標(biāo)簽上做標(biāo)記。

4.Wash Buffer FS2 使用前加入50mL乙醇（試用裝加5.0 mL），并在標(biāo)簽上做標(biāo)記。

5.準(zhǔn)備100個(gè)2.0 mL離心管（試用裝準(zhǔn)備10個(gè)2.0 mL離心管）。

6.如果沒有Fastprep儀器，可使用渦旋震蕩儀（推薦搭配相應(yīng)適配器），以最大速度渦旋10 min來裂解樣本。

7.14000 x g是推薦的離心速度，若離心機(jī)達(dá)不到可采用其最大速度離心。

裂解：     

     1    向Lysing Matrix E中加入30-200 mg糞便樣本。

           可選步驟：對雜質(zhì)含量高的糞便樣本可增加預(yù)洗步驟，向樣本中添加1mL Pre-Wash Buffer， 以最大速度渦旋混勻40 s，14,000 x g離心5分鐘，棄上清留沉淀。

     2    向糞便樣本或者預(yù)洗過的沉淀中加入980 µL Lysis Buffer F1，120 µL Lysis Buffer F2和 10 µL RNase A Solution，渦旋混勻10 s。

     3    使用FastPrep樣品制備儀，5.0 m/s 研磨40 s，或采用渦旋震蕩儀最大速度研磨10 min。

           備注：以上研磨條件適合于大多數(shù)樣本，但個(gè)別樣本需要的研磨速度和時(shí)間需要嘗試后確定。

     4    14,000 x g，離心5 min。

去雜：

     5    小心地吸取上清液（約800 µL）轉(zhuǎn)移至新的2.0 mL離心管（自備）。

     6    向離心管中加入250 µL Inhibitor Removal FS ，顛倒混合10次。

     7    1,4000 x g，離心5 min。

結(jié)合：

     8    小心地吸取上清液900 μL，轉(zhuǎn)移至新的2.0 mL離心管（自備）。

     9    向離心管中加入900 µL Binding Buffer FS ，渦旋混勻。

     10   將結(jié)合柱Column F1 裝入配套的2.0 mL收集管，向Column F1中加入800 µL 上述混合液。1,4000 x g，離心30 s，倒掉收集管中液體，再次安裝好收集管。重復(fù)一次本步驟。

漂洗：

     11   向Column F1中加入500 µL Wash Buffer FS1，1,4000 x g，離心30 s，倒掉收集管中液體，再次安裝好收集管。

     12   向Column F1中加入500 µL Wash Buffer FS2，1,4000 x g，離心30 s，倒掉收集管中液體，再次安裝好收集管，重復(fù)本步驟一次。

     13   不加任何試劑，1,4000 x g，離心2 min。

干燥：

     14   將丟棄2.0 mL收集管，將Column F1裝入配套的1.5 mL收集管。

     15   將Column F1在室溫條件干燥5 min。

     16   DES Buffer 提前置于 55 ?C 預(yù)熱。

洗脫：

     17   向Column F1柱膜中央加入100 µL 55℃預(yù)熱的DES Buffer，1,4000 x g，離心1 min。

     18   1.5 mL收集管中液體即為洗脫DNA，可應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn)，長期保存請置于-20?C ， 避免反復(fù)凍融。