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| 購(gòu)買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 m.kjhfd.cn |
慢病毒概述 慢病毒( Lentivirus)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)，為RNA病毒，如人免疫缺陷病毒(HIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、牛免疫缺陷病毒等。由于對(duì)HIV-1的研究最廣泛最深入，對(duì)其生物學(xué)特性最為了解，因此HIV-1來(lái)源的慢病毒載體已成為其中的代表。
圖1 HIV-1 RNA結(jié)構(gòu)圖 HIV-1為雙鏈RNA病毒，共有9個(gè)基因，如圖1所示。gag、pol、env3個(gè)基因編碼病毒的基本結(jié)構(gòu)，tat、rev為調(diào)節(jié)基因，vif、vpr、vpu、nef 4個(gè)為輔助基因。其中，gag基因編碼病毒的核心蛋白，包括基質(zhì)蛋白、衣殼蛋白、核衣殼蛋白；pol基因編碼病毒復(fù)制所需的酶，如反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶，env基因編碼病毒的包膜糖蛋白，決定病毒感染宿主的靶向性。rev編碼的蛋白調(diào)節(jié)gag、pol、env的表達(dá)水平，tat編碼的蛋白參與RNA轉(zhuǎn)錄的控制。4個(gè)輔助基因編碼的蛋白則作為毒力因子參與宿主細(xì)胞的識(shí)別和感染。兩端為長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR），內(nèi)含復(fù)制所需的順式作用元件，如包裝信號(hào)元件Ψ。 第一代慢病毒載體系統(tǒng)是以三質(zhì)粒系統(tǒng)為代表，該系統(tǒng)由包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒及載體質(zhì)粒3種質(zhì)粒組成。包裝質(zhì)粒是HIV-1前病毒基因組5’端LTR由巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子取代，3’LTR由SV40 polyA序列取代。包裝成分分別構(gòu)建在兩個(gè)質(zhì)粒上，一個(gè)表達(dá)gag和pol，另一個(gè)表達(dá)env。載體質(zhì)粒攜帶了5’端LTR，和全部5’端非翻譯區(qū)域，另外還帶有rev應(yīng)答元（RRE）。包膜表達(dá)質(zhì)粒使用水皰性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)用來(lái)代替了原病毒的env基因。 第二代慢病毒載體系統(tǒng)是在第一代的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，在包裝質(zhì)粒中刪除了HIV的所有輔助基因（vif、vpr、vpu和nef基因）。這些附屬基因的去除并不影響病毒的滴度和感染能力，同時(shí)增加了載體的安全性。 第三代慢病毒載體系統(tǒng)由四質(zhì)粒代替原有的三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)。將rev基因單獨(dú)放在一個(gè)包裝質(zhì)粒上。同時(shí)又增加了兩個(gè)安全特性：一是構(gòu)建自身失活的慢病毒載體，即刪除了U3區(qū)的3′LTR，使載體失去HIV-1增強(qiáng)子及啟動(dòng)子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能轉(zhuǎn)錄出RNA；二是去除了tat基因，用異源啟動(dòng)子序列代替，這樣原始的HIV-1基因組中的9個(gè)慢病毒載體中只保留了3個(gè)(gag、pol和rev)。因此第三代慢病毒載體系統(tǒng)更加安全。 慢病毒優(yōu)點(diǎn) 1、宿主范圍廣包裝病毒時(shí)用VSV-G基因代替了原病毒的env基因，宿主范圍更廣，如神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞。 2、感染能力強(qiáng)慢病毒載體對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，能感染絕大多數(shù)細(xì)胞，對(duì)一些難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，比如神經(jīng)元細(xì)胞、干細(xì)胞或其它原代細(xì)胞有較好的感染效率。 3、具有整合能力 慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)，因此可用于構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白/RNAi的細(xì)胞株，也可以用于制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
整體實(shí)驗(yàn)流程 慢病毒包裝技術(shù)路線：
包裝過(guò)程： （1)轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞接種到100mm dish中，控制細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)的密度為70-80%。 （2)轉(zhuǎn)染前一小時(shí)取出細(xì)胞培養(yǎng)板，去除原有細(xì)胞培養(yǎng)基，加入10ml的Opti-MEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱。 （3)制備轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒的復(fù)合物： 將待轉(zhuǎn)染的病毒載體質(zhì)粒32μg（骨架質(zhì)粒：穿梭質(zhì)粒=1:1）溶于Opti-MEM培養(yǎng)基，總體積為500μl，輕輕混勻，靜置5min。 將Lipofectmin2000轉(zhuǎn)染試劑溶于Opti-MEM培養(yǎng)基，總體積為500μl，輕輕混勻，靜置5min。 將Lipofectmin2000轉(zhuǎn)染試劑稀釋液滴加到質(zhì)粒稀釋液中，邊加邊輕輕混勻后在室溫放置20min，使DNALipofectmin2000轉(zhuǎn)染試劑充分結(jié)合形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合體。 取出細(xì)胞培養(yǎng)板，將上面配好的DNA- Lipofectmin2000轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合體加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，做好標(biāo)記，放回培養(yǎng)箱。 收毒： （1)轉(zhuǎn)染48h后，第一次收毒，收集培養(yǎng)基至50ml離心管中，做上標(biāo)記，并給細(xì)胞更換新鮮的完全培養(yǎng)基。 （2)轉(zhuǎn)染72h后，第二次收毒，收集培養(yǎng)基至50ml離心管中，做上標(biāo)記，丟棄細(xì)胞。 注：廢棄的含病毒的培養(yǎng)基加入84消毒液（1:20左右），浸泡一天后丟棄。接觸過(guò)病毒的槍頭，離心管，培養(yǎng)板等其他物品可用84消毒液稀釋液處理，也可以用煮沸處理半小時(shí)或高壓濕熱滅菌（121℃，30min）處理。 3.慢病毒純化： （1)普通離心機(jī)：3500rpm，10min，RT離心后，上清馬上倒入新的50ml離心管，0.45μm，過(guò)濾上清到超速離心管中。上清分裝到12支超速離心管，兩兩對(duì)應(yīng)配平衡，不夠的體積可用不含血清的培養(yǎng)基配平。 （2)超速離心機(jī)：HITACHI，30,000rpm，2h，4℃，離心后，可觀察到管壁一側(cè)有白色的病毒沉淀，做上記號(hào)。在安全柜中，打開(kāi)離心管，小心地棄上清，離心管倒扣在滅菌過(guò)的吸水紙上，棄未去除干凈的上清。每管根據(jù)沉淀量添加DPBS，80μl-120μl/管，用封口膜封住管口，4℃溶解沉淀過(guò)夜。 （3)將同一種病毒，逐管收集法收集病毒到最后一管，再用100μl DPBS收集2次，全部收到1.5ml 離心管中，按要求分裝病毒，標(biāo)記（病毒名稱，年-月-日）-80℃冰箱保存。 （4.）慢病毒滴度檢測(cè)（Real time 定量PCR 法測(cè)定滴度）： （1)樣品制備： （a)消化293T細(xì)胞，按1×105細(xì)胞每孔接種24孔板。 （b)細(xì)胞貼壁后（鋪板后4~6h）加入病毒。 （c)12~20h后換液，去掉含病毒的培養(yǎng)基。 （d)感染后72h拍照記錄熒光，收集細(xì)胞抽取基因組DNA并做定量PCR實(shí)驗(yàn)測(cè)定滴度。 （2)Real-time PCR 檢測(cè)： Real-time PCR 在ABI7500 上完成。SYBR Master Mixture 來(lái)自TAKARA。 (a)下列比例配置反應(yīng)體系：
(b) 設(shè)定程序?yàn)閮刹椒≧eal-Time 定量。預(yù)變性95℃，15s，之后每一步變性95℃，5s，退火延伸60℃，34s，共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。每次在延伸階段讀取吸光值。 (c) 制作熔解曲線。PCR 結(jié)束后， 在95℃變性1min。然后冷卻至55℃，使DNA 雙鏈充分結(jié)合。從55℃開(kāi)始到95℃，每一步增加0.5℃，保持30s， 同時(shí)讀取吸光值。
北京畢特博生物提供的慢病毒： 我們采用第三代4質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)，生物安全性更高； 采用VSV-G包膜，宿主范圍更廣； 產(chǎn)生的慢病毒滴度高，可達(dá)108~1010TU/mL； 各種慢病毒穿梭載體可供選擇：過(guò)表達(dá)、ShRNA、miRNA、Tet誘導(dǎo)表達(dá)載體等； 可帶有熒光報(bào)告基因（GFP、RFP、mCherry、Luciferase等）和藥篩標(biāo)記基因（Puromycin、Neomycin、Hygromycin等），有多種啟動(dòng)子（CMV、PGK、CAG、Ubc等）可供選擇； 3~4周內(nèi)即可完成病毒包裝服務(wù)。 運(yùn)輸和儲(chǔ)存 對(duì)于長(zhǎng)距離運(yùn)輸，應(yīng)先將慢病毒載體保存在-80℃，再采用全程干冰運(yùn)輸，以防滴度下降。 慢病毒載體在-80℃保存6個(gè)月，滴度不會(huì)明顯下降。建議保存6~12個(gè)月以上的樣品，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，重新測(cè)一次滴度。應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融（小于3次）。 使用前從-80℃取出病毒，立即放在37℃水浴鍋中，輕輕晃動(dòng)，使其盡快溶解，操作過(guò)程應(yīng)置于冰盒上進(jìn)行。用不完的 毒可以暫時(shí)放在4℃冰箱中，但最好盡快用完。
北京畢特博生物技術(shù)有限責(zé)任公司 http://m.kjhfd.cn 400熱線：400-833-9299 電話：010-82015225 傳真：010-62015131 聯(lián)系人：陳娉樺 QQ:358411186 E-mail:chenph1989@163.com |
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