簡介

 T 細胞在免疫細胞介導(dǎo)的靶向腫瘤治療中起到重要作用。使用體外活化擴增的 T 細胞進行過繼性免疫療法正在成為臨床環(huán)境中治療癌癥的有力工具。多篇報道指出了使用含有各種細胞因子（如 IL-2， IL-7，和 IL-21）可用于 T 細胞的活化和擴增。血清補充劑（如人自體血漿）是 T 細胞體外活化與擴增的重要添加劑。在本研究中，我們利用白細胞介素 -2（IL-2），抗人 CD3 抗體和抗人 CD28 抗體展示了康寧 88- 581-CM 培養(yǎng)基對人 T 細胞體外活化與擴增的應(yīng)用。同時研究了使用含有或不含 2% 人自體血漿的康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基體外培養(yǎng)人 T 細胞的相關(guān)結(jié)果。

材料和方法

  外周血單核細胞（PBMC）的制備

外周血單核細胞使用康寧淋巴細胞分離液 (LSM)(Corning  Cat.No.25-072-Cl)，按照產(chǎn)品使用說明提供的操作方法，從人源新鮮的外周血中分離獲得。獲得的外周血單核細胞用不含鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液 (PBS) 洗滌三次，離心去除多余的淋巴細胞和少量的殘留的紅細胞。離心參數(shù)設(shè)置如下： 第 1 次： 室溫，1500 rpm/min，10min；第 2 次：室溫，1200 rpm/min，10min；第 3 次：室溫，1000 rpm/min，10min。

  人 T 細胞的體外擴增

  通過免疫磁珠分選 CD3+ T 細胞，使用 EasySep™人 T 細胞分離試劑盒 (STEMCELL Technologies Cat. No. 17951) 從新鮮 PBMC 中分選人 CD3+ T 細胞。將 CD3+ T 細胞 (1×106 個細胞 / mL) 懸浮于含有 1µg/mL 抗人 CD28 抗體和 200 IU/mL IL-2 (Corning Cat. No. 354043) 的含有或不含自體血漿的Corning 88-581-CM 培養(yǎng)基中。將含有 2×106 個細胞的細胞懸液接種到用 5µg/mL 抗人 CD3 抗體預(yù)包被的 6 孔細胞培養(yǎng)板 (Corning Cat. No. 3516) 中的一個孔中，并在 37℃，5% CO2 的恒溫的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3 天。在第 4 天至 14 天，添加含有或不含人自體血漿的 200 IU/mL IL-2 的新鮮 Corning 581- 88-CM培養(yǎng)基將細胞密度維持在5×105 至2×106 個細胞/mL 之間。每天觀察細胞形態(tài)，培養(yǎng)至14 天， 離心收獲細胞。

 表型分析

 在第 0 天和第 14 天收集 T 細胞樣品，利用流式細胞儀對細胞表面標記物進行鑒定分析。本研究中， 我們通過檢測兩組T  細胞表面標記物（CD3+/CD8+、CD4+/CD45RO-）的表達水平來評價體外擴增后的 T 細胞質(zhì)量。具體操作參考 BD 提供的流式細胞檢測標準流程， 不同標記的細胞表面標記物抗體， 按 1:1 抗體 /105 細胞的比例，4℃避光孵育 15min 后，PBS 洗滌后利用 300uL PBS 重懸細胞并用流式細胞儀進行表性分析，同型對應(yīng)抗體作為對照。

結(jié)果

 將人 T 細胞在含有和不含 2% 人自體血漿的康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周。培養(yǎng)過程中出現(xiàn)細胞團簇與血漿的有無并無直接關(guān)系。圖 1 的結(jié)果表明補充含有 2% 血漿的細胞比在不含血漿的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞形成更多的細胞團簇。

 含有 2% 自體血漿的康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基

 當人 T 細胞在含有 2% 血漿的康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，到第 10 天時細胞會迅速增殖 100 倍至超過 1 億個細胞。 第 14 天收獲時，細胞已經(jīng)擴增了 250 倍約 6 億個細胞。相比不加血漿的康寧
88-581-CM 培養(yǎng)基，添加 2% 的自體血漿的 88-581-CM 培養(yǎng)基可明顯增加T 細胞的體外擴增能力（如圖 2）。

圖 1. 培養(yǎng)第 10 天細胞形態(tài) (A) 含有 2% 自體血漿的康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞。 (B) 不含血漿的康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞。 。

 圖 2. 使用含有 2% 人自體血漿的康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基的細胞生長和倍數(shù)擴增。不含自體血漿的 Corning® 88-581-CM 培養(yǎng)基為了評估不含自體血漿的康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基的擴增結(jié)果，我們將其與競爭品牌 G 同時進行 T 細胞的無血清體外擴增，并比較其擴增結(jié)果。當T 細胞在不額外添加血漿的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第 14 天時， 細胞產(chǎn)量（~2×108 個細胞）和擴增倍數(shù)（~100 倍；如圖 3）兩者沒有顯著差異。接下來我們評估了康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基在特定 T 細胞亞型擴增中的應(yīng)用。CD8+T 細胞能夠殺死癌細胞和病毒同時產(chǎn)生細胞因子，足夠數(shù)量的初始 T 細胞對于病原體的連續(xù)應(yīng)激反應(yīng)是必不可少的。使用康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基培養(yǎng)后，CD8+T 細胞和初始 T 細胞比例分別為 90.9% 和 5.3%，高于競爭品牌 G 培養(yǎng)基（分別為 89.1% 和 1.4%；如圖 4）。

圖 3. 細胞在康寧 88-581-CM 和競爭品牌 G 培養(yǎng)基中無血清培養(yǎng) 14 天增殖能力的比較。

圖 4. 細胞在康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基和競爭品牌 G 培養(yǎng)基擴增 T 細胞的表型分析。CD3+/CD8+ 為CD8+T 細胞；CD+/CD45RO- 為初始 T 細胞。此外，我們也評估了擴增 2×108 個 T 細胞所需的培養(yǎng)基總成本?？祵?88-581-CM 培養(yǎng)基的成本非常具有優(yōu)勢。在中國地區(qū)，其僅為競爭品牌 G 培養(yǎng)基成本的三分之一。

結(jié)論

康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基可以在無血漿或低自體血漿條件下成功活化和擴增 T 細胞，獲得高表達的CD8+ T 細胞和初始 T 細胞。雖然康寧 88-581-CM 培養(yǎng)基與競爭品牌 G 的培養(yǎng)基之間在 T 細胞增殖能力上沒有顯著差異，但在效應(yīng) T 細胞的比例上有明顯優(yōu)勢，且成本更低，為研究人員提供了更好的選擇。

保修/ 免責聲明：除非另有規(guī)定，所有產(chǎn)品僅供研究使用。不適用于診斷或治療程序。不適用于人類?？祵幧茖W(xué)從未聲稱這些產(chǎn)品可以用于臨床或診斷應(yīng)用。

Corning® KBM 581 淋巴細胞無血清培養(yǎng)基

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