白玉杰綜述 藥立波審校
(第四軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)及分子生物學(xué)教研室， 西安710032)
蛋白質(zhì)是生命功能的物質(zhì)基礎(chǔ)， 體內(nèi)包括復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、分泌、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝等多種生命活動都依賴于蛋白-蛋白、蛋白-核酸間的相互作用， 對生命活動過程中蛋白質(zhì)作用的研究有助于揭示生命過程的許多本質(zhì)問題。但由于蛋白質(zhì)與其他生物大分子間作用依賴于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境， 作用時間及作用力差異極大， 因而傳統(tǒng)生化方法受到較大限制， 蛋白-蛋白及蛋白-核酸間作用的研究進(jìn)展緩慢。新興起的雙雜交系統(tǒng)應(yīng)用有效的酵母遺傳學(xué)方法分析蛋白間相互作用， 能快速克隆編碼與某一蛋白作用的配體蛋白的基因， 得到廣泛應(yīng)用， 在此基礎(chǔ)上相繼出現(xiàn)反向雙雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)等多種新技術(shù)， 大大加速了此領(lǐng)域的研究。
一、酵母雙雜交系統(tǒng)
(一) 基本原理
酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song等首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立 i 。典型的真核生長轉(zhuǎn)錄因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二個不同的結(jié)構(gòu)域: DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activating domain)。前者可識別DNA上的特異序列， 并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游， 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用， 啟動它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。二個結(jié)構(gòu)域不但可在其連接區(qū)適當(dāng)部位打開， 仍具有各自的功能。而且不同兩結(jié)構(gòu)域可重建發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報道基因的表達(dá)探測蛋白－蛋白的相互作用。主要有二類載體: a 含DNA -binding domain的載體; b 含DNA-activating domain的載體。上述二類載體在構(gòu)建融合基因時， 測試蛋白基因與結(jié)構(gòu)域基因必須在閱讀框內(nèi)融合。融合基因在報告株中表達(dá)， 其表達(dá)產(chǎn)物只有定位于核內(nèi)才能驅(qū)動報告基因的轉(zhuǎn)錄。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-ad沒有。因此， 在GAL4-ad氨基端或羧基端應(yīng)克隆來自SV40的T-抗原的一段序列作為核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147); LexA (E coli轉(zhuǎn)錄抑制因子)的DNA-bd編碼序列。常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和皰疹病毒VP16的編碼序列等。
雙雜交系統(tǒng)的另一個重要的元件是報道株。報道株指經(jīng)改造的、含報道基因(reporter gene)的重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。最常用的是酵母細(xì)胞， 酵母細(xì)胞作為報道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點(diǎn): 〈1〉 易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒?！?〉具有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報道基因?！?〉酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白結(jié)合。一般編碼一個蛋白的基因融合到明確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA－結(jié)合結(jié)構(gòu)域(如GAL4-bd， LexA-bd)； 另一個基因融合到轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(如GAL4-ad， VP16)。激活結(jié)構(gòu)域融合基因轉(zhuǎn)入表達(dá)結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合基因的酵母細(xì)胞系中， 蛋白間的作用使得轉(zhuǎn)錄因子重建導(dǎo)致相鄰的報道基因表達(dá)(如lacZ)， 從而可分析蛋白間的結(jié)合作用。
酵母雙雜交系統(tǒng)能在體內(nèi)測定蛋白質(zhì)的結(jié)合作用， 具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷貝和強(qiáng)啟動子的表達(dá)載體使雜合蛋白過量表達(dá)。②信號測定是在自然平衡濃度條件下進(jìn)行， 而如免疫共沉淀等物理方法為達(dá)到此條件需進(jìn)行多次洗滌，降低了信號強(qiáng)度。③雜交蛋白間穩(wěn)定度可被激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物而增強(qiáng)， 后者又與啟動子DNA結(jié)合， 此三元復(fù)合體使其中各組分的結(jié)合趨于穩(wěn)定。④通過mRNA產(chǎn)生多種穩(wěn)定的酶使信號放大。 同時， 酵母表型， X-Gal及HIS3蛋白表達(dá)等檢測方法均很敏感。
(二) 酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用
1特點(diǎn)與優(yōu)點(diǎn)
酵母雙雜交系統(tǒng)的最主要的應(yīng)用是快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼基因。酵母雙雜交系統(tǒng)檢測蛋白之間的相互作用具有以下優(yōu)點(diǎn): ⑴ 作用信號是在融合基因表達(dá)后， 在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的， 省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。⑵ 檢測在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行， 可以在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。⑶ 檢測的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng)， 因而可檢測存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時的相互作用。⑷ 酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細(xì)胞類型和分化時期材料構(gòu)建cDNA文庫， 能分析細(xì)胞漿、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細(xì)胞部位及功能的蛋白。例如已報道成功分析了RAP1與RIF1ii、P21cip1與CDK2iii、p16與CDK4iv等之間的相互作用。
2結(jié)構(gòu)組成
酵母雙雜交系統(tǒng)可應(yīng)用于確定兩已知有生理作用的蛋白間的作用位點(diǎn)或結(jié)構(gòu)域。利用此系統(tǒng)已分析和測定了多種重要結(jié)構(gòu)域， 如p85三磷酸肌醇激酶和p110亞單位作用的結(jié)構(gòu)域v， p21cip1蛋白與增殖細(xì)胞膜抗原(proliferating-cell nuclear antigen， PCNA) 的結(jié)合序列vi等。
此外酵母雙雜交系統(tǒng)還應(yīng)用于闡明蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域，繪制蛋白質(zhì)聯(lián)系圖譜，在藥物設(shè)計等許多方面。
(三) 酵母雙雜交系統(tǒng)局限性和存在的問題
酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法， 有多方面的應(yīng)用， 但仍存在一些局限性。⑴ 雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi)， 而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等， 這些反應(yīng)在核內(nèi)無法進(jìn)行。 另外有些蛋白的正確折疊和功能有賴于其他非酵母蛋白的輔助， 這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究。⑵ 酵母雙雜交系統(tǒng)的一個重要的問題是"假陽性"。由于某些蛋白本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能或在酵母中表達(dá)時發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用， 使DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域雜交蛋白在無特異激活結(jié)構(gòu)域的情況下可激活轉(zhuǎn)錄。另外某些蛋白表面含有對多種蛋白質(zhì)的低親和力區(qū)域， 能與其他蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物， 從而引起報告基因的表達(dá)， 產(chǎn)生"假陽性"結(jié)果。
許多研究者對雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)和發(fā)展，。例如采用假陽性顯示分析法和雙篩選系統(tǒng)以減少"假陽性"的發(fā)生；發(fā)展哺乳動物雙雜交系統(tǒng)更好地研究蛋白將的相互作用。其中雙篩選系統(tǒng)用二種不同的報告基因(常用lacZ和HIS3)有以下優(yōu)勢vii:⑴ 用不同的啟動子表達(dá)位于酵母二個染色體上的報告基因， 可明顯減少假陽性。⑵ 通過營養(yǎng)型篩選增強(qiáng)了篩選能力， 尤其適用于對較大的庫容量而被選蛋白較少情況下的篩選。
哺乳動物雙雜交系統(tǒng)viii也是一種基因水平上以重建轉(zhuǎn)錄因子功能為基礎(chǔ)的體內(nèi)分析方法。在此系統(tǒng)中，一種感性趣的蛋白與Gal4--DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成融合蛋白，另一種蛋白與單純皰疹病毒VP16蛋白的激活結(jié)構(gòu)域以融合蛋白表達(dá)。表達(dá)這些融合蛋白的載體與一個報道載體（CAT）共同轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞系。報道質(zhì)粒含一個Gal4結(jié)合位點(diǎn)下游的cat基因。假如兩個融合蛋白相互作用則cat報道基因表達(dá)水平明顯增高。用此系統(tǒng)證實(shí)了P53蛋白與大T抗原的相互作用， 得到了酵母雙雜交系統(tǒng)相同的結(jié)果。且較酵母雙雜交系統(tǒng)更為快速，在轉(zhuǎn)染48h內(nèi)得到結(jié)果。并且在哺乳動物細(xì)胞能更好模仿體內(nèi)的蛋白-蛋白相互作用。因而，哺乳動物雙雜交系統(tǒng)可作為酵母雙雜交系統(tǒng)的輔助手段
二、反向酵母雙雜交系統(tǒng)
確定了蛋白之間的相互作用后， 更重要的工作是研究其功能、結(jié)構(gòu)及其作用的條件調(diào)節(jié)。鑒定在相互作用的一對蛋白中的任一蛋白突變對其相互作用的抑制作用， 不僅有助于探索相互作用的結(jié)構(gòu)單位， 而且可作為研究體內(nèi)功能的遺傳學(xué)方法。這對于多個作用分子的蛋白就更為重要。
1996年Vidalix x等建立了反向酵母雙雜交系統(tǒng)(reverse two-hybrid system)， 提供了簡便的鑒定阻斷蛋白間相互作用的方法。反向酵母雙雜交系統(tǒng)的關(guān)鍵是摻入一種表達(dá)產(chǎn)物對細(xì)胞生長有毒的報導(dǎo)基因， 用于監(jiān)測蛋白間的相互作用。例如酵母URA3基因表達(dá)產(chǎn)物是尿嘧啶合成所必需的， 同時它又可催化5-氟乳清酸(5-FOA)轉(zhuǎn)化為有毒物質(zhì)。Vidal等構(gòu)建了一酵母細(xì)胞株， 其URA3的表達(dá)由含GAL4結(jié)合位點(diǎn)的啟動子嚴(yán)密控制。此細(xì)胞株在缺乏尿嘧啶的培養(yǎng)基中培育需要GAL4激活結(jié)構(gòu)域(GAD)和GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(GBD)的融合蛋白的相互作用的表達(dá)。而在含5-FOA的完全培養(yǎng)基中則受GAD和GBD融合蛋白相互作用的抑制。因此可通過篩選5-FOA抗性克隆從隨機(jī)突變庫中鑒定阻斷蛋白相互作用的突變體。
反向雙雜交系統(tǒng)可更有效地蛋白間作用的關(guān)鍵位點(diǎn)或起決定作用的個別氨基酸， 進(jìn)而分析蛋白結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。此外此系統(tǒng)還可篩選能阻止某些蛋白間相互作用的肽或小分子物質(zhì)用作臨床治療制劑。
三、酵母三雙雜交系統(tǒng)
三雜交系統(tǒng)(three-binding hybrid system)用于分析蛋白和RNA間的相互作用。Senguptaxi等首先報道了應(yīng)用三雜技系統(tǒng)分析金屬調(diào)節(jié)蛋白(iron regulatory protein-1，IRP1)與金屬反應(yīng)元件(iron response element，IRE)RNA序列，以及HIV轉(zhuǎn)錄激活蛋白(trans-activator protein， Tat)與HIV轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)元件(HIV trans-activation response element，TAR)RNA序列間的作用。
三雜交系統(tǒng)的基本原理是將一個已知的RNA結(jié)合蛋白與轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合domain(如LexA)構(gòu)建第一個融合蛋白，第二種蛋白(待選的RNA結(jié)合蛋白)與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域構(gòu)建融合蛋白。此外構(gòu)建和表達(dá)一雜合RNA，含有二個不同的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)RNA與二個RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)相互作用時可激活報道基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。如Dhruba等在IRP1與IRE的RNA相互作用的研究中，第一個RNA結(jié)合蛋白選用噬菌體MS2被殼蛋白(MS2 coat protein)，MS2 coat protein可識別RNA中的21nt的莖環(huán)序列，并與之有較高的親和力。將其與LexA融合構(gòu)建雜合蛋白。IRP1與Gal4的激活結(jié)構(gòu)域(activation domain)融合構(gòu)建另一個雜合蛋白。IRE mRNA在非編碼區(qū)有21nt的莖環(huán)區(qū)序列，編碼區(qū)編碼與IRP1特異性結(jié)合的蛋白序列。在實(shí)驗(yàn)中他們用一質(zhì)粒表達(dá)雜交RNA，含2個MS2 coat protein結(jié)合位點(diǎn)和1個IRE。
三雜交系統(tǒng)提供了快速、多用的體內(nèi)檢測RNA-蛋白間相互作用的新方法。與雙雜交系統(tǒng)相比，雜交RNA與雜交蛋白有些不同：首先，雜交RNA分子可能不是生理結(jié)構(gòu)，雜交的不同RNA組分對正常結(jié)構(gòu)會有一定影響。但Dhruba的研究表明，局部、相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)區(qū)如MS2 coat protein，IRP1識別位點(diǎn)等可在體內(nèi)共存于同一雜交RNA分子中。其次，這些RNA中的莖環(huán)區(qū)結(jié)構(gòu)相當(dāng)穩(wěn)定，RNA只要形成部分正確結(jié)構(gòu)，則足以介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活作用。
象雙雜交系統(tǒng)一樣，三雜交系統(tǒng)具有廣泛的應(yīng)用。〈1〉應(yīng)用此系統(tǒng)可分析確定RNA--蛋白作用的精確結(jié)構(gòu)域，甚至單個核苷酸或氨基酸殘基。〈2〉用于鑒定和克隆識別結(jié)合有重要生理功能RNA(如轉(zhuǎn)錄、定位、RNA病毒包裝和感染等)的蛋白質(zhì)，可用于調(diào)控的機(jī)理研究、疾病的防治以及抗病毒藥物的研制開發(fā)。〈3〉通過構(gòu)建雜交RNA庫，可篩選與特定蛋白結(jié)合的RNA?！?〉有可能在此基礎(chǔ)上發(fā)展四雜交系統(tǒng)研究RNA-RNA間的相互作用。
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