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胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程 6/28/01
目錄
一、細(xì)胞
二、一般培養(yǎng)-保持胚胎干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)
培養(yǎng)基
細(xì)胞復(fù)蘇
凍存細(xì)胞
明膠包被
細(xì)胞傳代
三、體外分化
培養(yǎng)基
包被有多聚鳥(niǎo)氨酸/纖維結(jié)合蛋白的培養(yǎng)板（使用或不使用蓋玻片）
體外分化方法
四、移植細(xì)胞的準(zhǔn)備
細(xì)胞
多能性胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生于小鼠胚泡
1．表達(dá)綠色熒光蛋白（EGFP）的B5-ES細(xì)胞。由Dr. Nagy的實(shí)驗(yàn)室制備。
2．D3-ATCC; CRL-1934. 我們得到時(shí)大約傳了17代。
3．J1-由Dr. Jaenish的實(shí)驗(yàn)室友情提供。我們得到時(shí)大約傳了7－9代。
4．J1rtTA-rtTA表達(dá)J1細(xì)胞，由Dr. Jaenish的實(shí)驗(yàn)室友情提供。
5．表達(dá)黃色熒光蛋白的YC5-ES細(xì)胞，由Dr. Nagy的實(shí)驗(yàn)室提供。
一般培養(yǎng)--維持ES細(xì)胞處于未分化狀態(tài)
ES細(xì)胞培養(yǎng)用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培養(yǎng)基來(lái)阻止細(xì)胞的分化。為細(xì)胞提供包被有0.1％明膠的平板作為粘附細(xì)胞的基質(zhì)。建議每2－3天從達(dá)到80％－90％融合的平板按1：8的比率傳代細(xì)胞一次，細(xì)胞傳代以后，在將細(xì)胞接種在0.1％明膠包被的培養(yǎng)皿之前，通過(guò)預(yù)先將細(xì)胞接種在沒(méi)有經(jīng)過(guò)包被的組織培養(yǎng)板2個(gè)小時(shí)，使分化細(xì)胞粘附，從而將分化和未分化細(xì)胞分開(kāi)。將細(xì)胞全程置于37℃，5％CO2，100％濕度條件下培養(yǎng)。
培養(yǎng)基
ES:
配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（該溶液也能用于EB培養(yǎng)基--見(jiàn)下文）。分裝在50ml FALCON管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。通過(guò)將21ml該溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基，0.2μm濾膜過(guò)濾。貯存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。
貯存液
DMEM(高糖)
馬血清（HS）
L-谷氨酰胺（200mM）
MEM NEAA（10mM）
HEPES（1M）
β-巰基乙醇（55Mm）
PEST
ESGRO
復(fù)蘇細(xì)胞
細(xì)胞被凍存在10％二甲基亞砜（DMSO）中防止結(jié)晶的形成，結(jié)晶的形成會(huì)損害細(xì)胞。然而，二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞有毒性，快速的進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇是很重要的。
步驟：
1．從液氮中取出一管細(xì)胞；
2．將凍存管置于37℃水浴中2分鐘（或放到管內(nèi)溶液恰好完全溶解）；
3．將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一15ml Falcon管中；
4．加入5ml ES培養(yǎng)基（用培養(yǎng)基沖洗凍存管）；
5．離心3分鐘；
6．棄上清，用2ml ES培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，至少吹打10次；
7．接種在明膠包被（見(jiàn)下文）的6孔或6cm組織培養(yǎng)皿；
8．孵育。
凍存細(xì)胞
凍存液
90％HS和10％二甲基亞砜
步驟：
1．1×PBS洗細(xì)胞并留少許PBS在培養(yǎng)皿內(nèi)；
2．用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞；
3．將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15ml Falcon管內(nèi)并離心3分鐘；
4．棄去上清并將細(xì)胞重懸于冷的凍存液中（10cm的培養(yǎng)皿用2ml，15cm的培養(yǎng)皿用6－7ml。）
5．分裝于凍存管內(nèi)，每管1ml；
6．置－80℃過(guò)夜，第二天移入液氮。
明膠包被
準(zhǔn)備500ml 0.1％明膠溶液
1．將0.5g明膠溶解在500ml無(wú)鈣鎂的PBS中（50－65℃水浴15～30分鐘）。
2．最好在溶液沒(méi)有冷卻的情況下通過(guò)0.2μm濾膜過(guò)濾，貯存在4℃。
包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿
1．加入足量的明膠溶液覆蓋培養(yǎng)平面（15cm培養(yǎng)皿加2ml，10cm培養(yǎng)皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆蓋培養(yǎng)表面就行了。）；
2．置室溫30分鐘；
3．去除明膠溶液，將培養(yǎng)板貯存在包裝袋中室溫放置，最好將板子平方，以免明膠污染蓋子和流出培養(yǎng)板。
細(xì)胞傳代
建議每2－3天傳代細(xì)胞一次，過(guò)度生長(zhǎng)的細(xì)胞會(huì)降低細(xì)胞的自然分化率，我們建立了一種純化方法來(lái)去除分化細(xì)胞，在將細(xì)胞接種在明膠包被的培養(yǎng)板上之前，通過(guò)將分化細(xì)胞黏附在沒(méi)有包被的組織培養(yǎng)板上去除分化細(xì)胞。純化步驟包含在下面的方法中。
1．去除培養(yǎng)液；
2．1×無(wú)鈣鎂PBS洗滌；
3．加入1×胰酶EDTA(10×胰酶EDTA用PBS稀釋。)37℃孵育5分鐘。
4．加入ES培養(yǎng)基使胰酶失活；
5．將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15ml離心管中離心3min；
6．去除上清，將細(xì)胞重懸于2mlES培養(yǎng)基，至少吹打10－20次。
如果加入培養(yǎng)基的量較少會(huì)比較容易將細(xì)胞團(tuán)弄散分開(kāi)。ES細(xì)胞有聚集成團(tuán)的傾向，傳代過(guò)程中仔細(xì)將細(xì)胞弄散分開(kāi)很重要。這樣可能會(huì)減少細(xì)胞的自然分化。
7．將細(xì)胞接種在沒(méi)有包被的組織培養(yǎng)皿中（使用和一開(kāi)始同樣規(guī)格的培養(yǎng)皿）放入溫箱2小時(shí)（分化細(xì)胞在該時(shí)間內(nèi)將黏附，而ES細(xì)胞仍將保持懸浮）；
8．將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入明膠包被（見(jiàn)下文）的組織培養(yǎng)皿。吹打以確保細(xì)胞被分散開(kāi)（前面已經(jīng)提到--ES細(xì)胞有聚集成團(tuán)的傾向）
9．建議按1：4－1：10的比率傳代(ATCC)
保持細(xì)胞的傳代比率很重要，以我們的經(jīng)驗(yàn)，1：8的比率是好的，可以使細(xì)胞的自然分化降到最低。當(dāng)你使用不同規(guī)格的培養(yǎng)板進(jìn)行細(xì)胞傳代可以使用表1來(lái)計(jì)算傳代比率。
體外分化
多能胚胎干細(xì)胞在體內(nèi)外可以分化為各種類型的細(xì)胞。我們的體外分化方法有利于神經(jīng)前體細(xì)胞通過(guò)在最少量的培養(yǎng)基內(nèi)選擇（第3步），在有bFGF存在的情況下擴(kuò)增（第4步）并最終分化在第5步。細(xì)胞全程培養(yǎng)在37℃，5％CO2，100％濕度條件下。
時(shí)間線（總時(shí)間為27～34天）
第2步；4＋1天 第3步；4－10天 第4步；4天 第5步；10－15天
培養(yǎng)基
EB
配制一20×不含DMEM，F(xiàn)BS，ESGRO的溶液（該溶液也能用于ES培養(yǎng)基--見(jiàn)前述）。分裝在50ml FALCON管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。將21ml該溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基，0.2μm濾膜過(guò)濾。貯存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。
貯存液
DMEM(高糖)
胎牛血清
L-谷氨酰胺（200mM）
MEM NEAA（10mM）
HEPES（1M）
β-巰基乙醇（55Mm）
PEST（P104U/mlS104μg/ml
ITSFn and N3：
配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分裝在15ml FALCON管中，（稀釋為1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml），0.2μm濾膜過(guò)濾，貯存在-20℃。將該溶液加入DMEM/F12中制備培養(yǎng)基，貯存于4℃。
貯存液
DMEM(高糖)
轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg/ml
胰島素5mg/ml
亞硒酸鈉300μM
黃體酮（20μM）
腐胺（100μM）
PEST（P104U/ml S104μg/ml）
層粘連蛋白100μg/ml
纖維連接蛋白250μg/ml
堿性rhFGF, 10μg/ml
*在第4步將bFGF加入N3培養(yǎng)基使終濃度為10ng/ml。
ITSFn and N3培養(yǎng)基貯存液的準(zhǔn)備
使用無(wú)菌的溶劑和稀釋液，在分裝之前要對(duì)溶液進(jìn)行過(guò)濾，如果因?yàn)槟承┰蛉芤涸诜盅b之前沒(méi)有進(jìn)行過(guò)濾，需要在管子上標(biāo)明以便別人在使用時(shí)知道該溶液不能直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。
貯存液 溶劑，貯存液，稀釋劑和儲(chǔ)存
轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg/ml
胰島素5mg/ml
亞硒酸鈉300μM
黃體酮（20μM）
腐胺（100μM）
PEST（P104U/ml S104μg/ml）
層粘連蛋白（100μg/ml）
纖維連接蛋白（250μg/ml ）
堿性rhFGF, （10μg/ml）
包被有多聚鳥(niǎo)氨酸/纖維結(jié)合蛋白的培養(yǎng)板（使用或不使用蓋玻片）
包被液的準(zhǔn)備
多聚-L-鳥(niǎo)氨酸，15μg/ml
把75ml多聚-L-鳥(niǎo)氨酸和425ml 1×PBS混合。貯存在4℃。
纖維結(jié)合蛋白，1μg/ml
把0.5ml纖維結(jié)合蛋白和500ml 1×PBS混合。
包被過(guò)程：
1．加入多聚-L-鳥(niǎo)氨酸，至少2－3小時(shí)（過(guò)夜也行）
2．吸出多聚-L-鳥(niǎo)氨酸
3．加入纖維結(jié)合蛋白，大約1－2小時(shí)
4．吸出纖維結(jié)合蛋白，放置30分鐘晾干
5．貯存在4℃
24孔板用200μl，6孔板用500μl。震蕩培養(yǎng)板確保溶液能夠覆蓋蓋玻片或培養(yǎng)孔。有時(shí)需要?jiǎng)×艺鹗幣囵B(yǎng)板。
體外分化方法
第1步：ES培養(yǎng)基
在LIF（ESGRO）存在的條件下維持細(xì)胞培養(yǎng)
第2步：EB培養(yǎng)基
使用細(xì)菌培養(yǎng)皿去除LIF后胚狀體的形成需要4天。
1．分散純化細(xì)胞（參見(jiàn)上面的細(xì)胞傳代部分）
2．純化2小時(shí)后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有ES培養(yǎng)基的50ml Falcon管中，計(jì)數(shù)細(xì)胞取適量體積放入15ml管中離心3分鐘。
3．用2mlEB培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吹打至少10次制成單細(xì)胞懸液
4．一個(gè)15cm的細(xì)菌培養(yǎng)皿接種4～5×106個(gè)細(xì)胞（1個(gè)完全融合的組織培養(yǎng)皿通常足以接種4個(gè)同樣規(guī)格的細(xì)菌培養(yǎng)皿）。
5．2天后更換培養(yǎng)基
將胚狀體轉(zhuǎn)入錐形管中放置3～5分鐘使細(xì)胞沉降。棄去上清，將細(xì)胞重懸于新鮮培養(yǎng)基并接種在新的細(xì)菌培養(yǎng)皿中。
6．用EB培養(yǎng)基培養(yǎng)的第4天將細(xì)胞轉(zhuǎn)入沒(méi)有包被的組織培養(yǎng)皿中（這即是細(xì)胞的移植步驟）。1個(gè)組織培養(yǎng)皿之中放置1個(gè)細(xì)菌培養(yǎng)皿，在進(jìn)行第3步之前一天將胚狀體黏附在同樣規(guī)格的培養(yǎng)板上。
形成胚狀體需要4天時(shí)間。在EB培養(yǎng)基中再培養(yǎng)1天使胚狀體粘附在組織培養(yǎng)皿的表面。這一天被認(rèn)為是第2步和第3步的分界。
第3步--ITSFn培養(yǎng)基
在最少量培養(yǎng)基中選擇神經(jīng)前體細(xì)胞
1．在胚狀體接種在組織培養(yǎng)皿一天后將培養(yǎng)基換成ITSFn培養(yǎng)基
2．并非所有胚狀體在這一時(shí)期都已經(jīng)發(fā)生粘附，因此在移除培養(yǎng)基時(shí)要小心謹(jǐn)慎以使大部分胚狀體留在培養(yǎng)皿內(nèi)。
3．保持細(xì)胞在ITSFn中培養(yǎng)大約10天，根據(jù)需要更換培養(yǎng)基--大約每隔一天。
觀察細(xì)胞形態(tài)，神經(jīng)樣細(xì)胞大約出現(xiàn)在第4到第7天。當(dāng)神經(jīng)樣細(xì)胞能夠被鑒別時(shí)，轉(zhuǎn)入到第4步。步驟的轉(zhuǎn)換應(yīng)該在神經(jīng)前體細(xì)胞出現(xiàn)第一個(gè)清晰的標(biāo)志幾天以后，通常是在第3步的第6到第10天。
第4步－N3培養(yǎng)基＋bFGF
通過(guò)將神經(jīng)前體細(xì)胞培養(yǎng)在含有10ng/ml bFGF的培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增。
1.PBS洗滌，加入2ml 1×胰酶（1個(gè)15cm的培養(yǎng)皿所需胰酶的量根據(jù)前文表中的體積）（10×胰酶EDTA用PBS稀釋）
2．37℃孵育5分鐘
3．用4mlEB培養(yǎng)基終止胰酶活性，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入錐形管中放置3～5分鐘移出細(xì)胞團(tuán)，將上清移入一新的離心管離心。
4．將細(xì)胞重懸于含有bFGF的N3培養(yǎng)基。
5．將細(xì)胞接種在包被多聚-L-鳥(niǎo)氨酸/纖維連接蛋白的蓋玻片上（最好將蓋玻片放于24孔培養(yǎng)板或6孔培養(yǎng)板，6孔培養(yǎng)板中每孔放置5個(gè)蓋玻片如果是塑料的放置4個(gè)，以使最大可能的獲得樣品數(shù)量）。24孔板接種3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。
6．2天后更換培養(yǎng)基
第5步－N3培養(yǎng)基
通過(guò)撤除bFGF使神經(jīng)前體細(xì)胞分化
1．細(xì)胞被接種在蓋玻片上4天后將培養(yǎng)基換成不含bFGF的N3培養(yǎng)基
2．根據(jù)需要換液（大約每隔一天）
3．分化10～15天后固定細(xì)胞
移除培養(yǎng)基
PBS洗滌
加入4%福爾馬林
室溫放置30分鐘
PBS洗滌2次
儲(chǔ)存于PBS。長(zhǎng)期儲(chǔ)存使用含0.01％疊氮化納的PBS
移植細(xì)胞的準(zhǔn)備
細(xì)胞在胚狀體形成4天以后被移植（相應(yīng)于體外分化過(guò)程中的第2步末細(xì)胞被轉(zhuǎn)種到組織培養(yǎng)板）。正如在前文體外分化中所描述的在移植之前4天開(kāi)始形成胚狀體。通常再需要一天時(shí)間以便將胚狀體移植入一10cm的培養(yǎng)皿。
移植
1．將胚狀體轉(zhuǎn)移至一15ml 圓錐形管中放置3～5分鐘使胚狀體沉降下來(lái)。
細(xì)胞被離心3分鐘會(huì)更好。放置使之沉降將會(huì)去除更多的單個(gè)細(xì)胞（包括死細(xì)胞）而這些細(xì)胞可以被離心下來(lái)。
2．去除上清將胚狀體重懸于無(wú)鈣鎂離子的1×PBS中
3．離心3分鐘
4．去除上清加入1×胰酶（10cm的培養(yǎng)皿加1ml）
5．37℃水浴5分鐘
6．加入5mlEB培養(yǎng)基小心吹打約10次
小心處理細(xì)胞很重要，進(jìn)行細(xì)胞傳代分散細(xì)胞時(shí)不可劇烈吹打。
7．離心2分鐘
8．吸出上清將細(xì)胞重懸于500μl EB培養(yǎng)基
9．用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次
10．離心2次
11．吸出上清將細(xì)胞重懸于100μl EB培養(yǎng)基
煙酸己可堿標(biāo)記ES細(xì)胞進(jìn)行移植
1．準(zhǔn)備一10μg/ml的煙酸已可堿染液（雙苯酰亞胺，在冷凍室118）
2．加入1mg（你能稱到的最小量）到5ml EB培養(yǎng)基（制成200μg/ml）
3．將溶液稀釋成10μg/ml （100μl 200μg/ml 溶液和1.9ml EB培養(yǎng)基）
4．如前所述將細(xì)胞重懸于2ml煙酸已可堿染液而不是EB培養(yǎng)基中制備ES細(xì)胞懸液，
5．將懸液置于室溫（或冰上）30分鐘
6．離心2分鐘
7．吸出上清將細(xì)胞重懸于2ml EB培養(yǎng)基
8．重復(fù)一次
9．離心2分鐘
10．吸出上清將細(xì)胞重懸于100μl EB培養(yǎng)基并置于冰上。
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