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| 購買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 m.kjhfd.cn |
土壤中抗生素抗性基因豐度不斷增加 C.W. Knapp, J. Dolfing, P.A.I Ehlert, et al. 前言 在過去的幾十年里，抗生素抗藥性（AR）引起了越來越多的關(guān)注?？辜籽跷髁纸瘘S葡萄球菌（MRSA）、抗萬古霉素腸球菌（VRE）等具有傳染性的“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)正在威脅著世界范圍內(nèi)的健康服務(wù)系統(tǒng)。有趣的是，環(huán)境微生物（即腸道系統(tǒng)之外的物種）對(duì)抗生素化合物的抗性是一個(gè)自然現(xiàn)象，特別是在土壤中更是如此；然而，至今還不清楚超級(jí)細(xì)菌的傳染性與環(huán)境微生物的抗性是什么樣的相互關(guān)系。例如，盡管二次大戰(zhàn)以來抗生素和抑菌劑的工業(yè)生產(chǎn)顯著增加，但還不清楚自然土壤中的AR背景值是否發(fā)生了變化。這可能是因?yàn)榄h(huán)境微生物同時(shí)暴露于抑菌劑、重金屬以及其他不利環(huán)境之中，致病微生物可能會(huì)在土壤有機(jī)體中為抗性特征提供匯集的場所，這將對(duì)公眾健康造成更為廣泛的不利影響。雖然不能明確超級(jí)細(xì)菌與環(huán)境有機(jī)體之間的關(guān)系，但將現(xiàn)在土壤中與大范圍抗生素工業(yè)生產(chǎn)之前土壤中AR的水平（作為研究的初始點(diǎn)）加以對(duì)比也是非常有意義，這也是本研究的基礎(chǔ)。 青霉素是最早被廣泛使用的一種抗生素（1928年Alexander Fleming發(fā)現(xiàn)），在20世紀(jì)40年代早期實(shí)現(xiàn)了大批量生產(chǎn)。隨后很快鏈霉素、四環(huán)素和其他抗生素也進(jìn)入了工業(yè)生產(chǎn)階段。生產(chǎn)能力的不斷提高以及價(jià)格的不斷下降促進(jìn)了抗生素在醫(yī)療領(lǐng)域之外的應(yīng)用。例如，研究發(fā)現(xiàn)低劑量的抗生素能夠促進(jìn)牲畜的生長，因此常被作為預(yù)防藥劑加入到動(dòng)物飼料中。隨著應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴(kuò)大，抑菌劑的生產(chǎn)和使用不斷增加。盡管還無法準(zhǔn)確計(jì)算抗生素的年使用量及年生產(chǎn)量，但貿(mào)易數(shù)據(jù)顯示，在1990年前抗生素的生產(chǎn)呈現(xiàn)指數(shù)增加的趨勢(shì)，其中大于50%的抗生素被用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域。 抗性生物的發(fā)現(xiàn)使得抑菌劑在人類藥物及農(nóng)業(yè)方面的使用更加審慎，但依然能在城市污水、地表水、海洋、沉積物及土壤中檢測出抗生素抗性基因（ARG）。另外，有跡象表明環(huán)境中抗性微生物能夠積蓄AR特性，它們可能會(huì)通過水平基 因傳遞或其他機(jī)制將對(duì)抗生物的抗性傳遞給病原體。因此評(píng)價(jià)抗生素和抑菌劑的使用是否已經(jīng)改變并持續(xù)改變自然中的“背景”抗性水平，判斷環(huán)境生物體是否有機(jī)會(huì)將抗性傳遞給病原體就顯得非常重要了。 幸運(yùn)的是，最近的研究發(fā)現(xiàn)，檔案土壤提取出的DNA為了解歷史微生物群落提供了非常有價(jià)值的信息。在這種理念的指導(dǎo)下，我們獲取了荷蘭鄉(xiāng)村5個(gè)長期監(jiān)測點(diǎn)位1940~2008年間的檔案土壤樣品，定量分析了土壤中18種抗性決定子（包括針對(duì)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、四環(huán)素、紅微素和糖肽類抗生素的ARG）的豐度。盡管ARG并不一定實(shí)現(xiàn)抗性的表達(dá)，但它們能夠反映抗性的“潛力”，這也是唯一可用的標(biāo)記物，可以比較它們?cè)跉v史樣品中豐度的差異并研究長期的變化趨勢(shì)。本研究采用的檔案土壤在土壤類型、灌溉水和肥料使用歷史、重金屬暴露等方面具有差異，這也為研究ARG水平的影響因素提供了便利條件。最后測定了微生物16S-rRNA基因水平，用來比較采集時(shí)土壤中的微生物水平，評(píng)價(jià)土壤儲(chǔ)存條件對(duì)DNA的影響，利用每個(gè)土壤中的微生物總量將ARG水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，利于盡心對(duì)比分析。 材料與方法 采用的檔案土壤 土壤樣品來源荷蘭瓦格寧根大學(xué)和研究中心的TAGA土壤檔案系統(tǒng)。TAGA系統(tǒng)包括1879年以來多項(xiàng)研究所用的土壤，本研究采用土壤基本情況見表1（表略），其地理位置見圖1（圖略）。需要特別強(qiáng)調(diào)的是土壤采集的目的并不是用于該研究，采樣點(diǎn)位有用的背景信息較少，較為久遠(yuǎn)的土壤更少如此。因此，我們必須限定本研究的結(jié)論，只能得出一個(gè)總體趨勢(shì)而非詳細(xì)的特征信息。 例如，點(diǎn)位A位于Wieringerwerf，在1960年至1986年間的一項(xiàng)關(guān)于濱海粉質(zhì)壤土再利用的農(nóng)業(yè)研究中采集了土壤樣品。該點(diǎn)位于1930年從Waddenzee收回，在1940年左右開始用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，1955年開始燕麥、小麥和馬鈴薯輪作，為了研究無機(jī)肥料對(duì)作物輪作的影響研究人員采集了土壤樣品。該點(diǎn)位主要使用礦物肥料，包括氮磷鉀肥，在該研究期間，燕麥種植時(shí)也間歇性地施用了有機(jī)肥，施用量約為135t/hm2，但是有機(jī)肥添加的具體時(shí)間沒有詳細(xì)記錄。點(diǎn)位B位于荷蘭東部的Heino，土壤為腐殖砂土（1950~1971年），施用了有機(jī)肥及無機(jī)肥料，試驗(yàn)期間的有機(jī)肥使用量約為1 250t/hm2。由于較大的有機(jī)肥使用量，因此我們將該點(diǎn)位假定為有較高ARG水平的“正參照”，但是研究結(jié)果并非如此。 點(diǎn)位C位于Wieringerwerf的Slootdorp村莊，土壤類型為濱海粉質(zhì)壤土，為了評(píng)價(jià)鉀肥的功效進(jìn)行了田間試驗(yàn)，在1940~1975年間采集了表層土壤樣品（0~25 cm）。試驗(yàn)期間鉀肥的施用量約為80t/hm2，時(shí)間約為20世紀(jì)60年代，準(zhǔn)確時(shí)間未記錄。點(diǎn)位D的土壤主要是輕度濱海粘土，與Wieringerwerf的土壤（點(diǎn)位A和C）較為類似，灌溉水來自于艾塞爾湖的入口。點(diǎn)位E主要為砂土（76.8%的砂子，16~2 000μm），地下水位多變（冬季小于1m，夏季大于1.5m）。點(diǎn)位D和E主要研究磷礦粉作為磷肥的可行性，沒有添加有機(jī)肥，都具有溝渠灌溉系統(tǒng)，但點(diǎn)位E的灌溉水來自VAM kanaal和Oude Diep，而非艾塞爾湖。 樣品處理及DNA提取 土壤在30~40℃下風(fēng)干，研磨，檔案室內(nèi)室溫下保存。土壤DNA提取采用UltraClean土壤DNA提取試劑盒，在廠家操作手冊(cè)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一些修改。稱量150~300mg的土壤（干重）放入事先準(zhǔn)備好的裝有緩沖液和提取劑的離心管中。緩沖液預(yù)冷至4℃，樣品培養(yǎng)30min使其再水化。在Hybaid Ribolyzer中進(jìn)行細(xì)胞溶解，樣品在70℃下培養(yǎng)10min以幫助革蘭氏陽性菌的溶解，在ribolyzer中再次震蕩。根據(jù)廠家操作手冊(cè)對(duì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步的純化。DNA提取液在-20℃下短暫保存（若長期保持則要在-80℃下）。前期研究表明，DNA干燥和保存對(duì)原核和真核微生物的可檢測部分沒有明顯的影響，本研究再次驗(yàn)證了這一點(diǎn)。 qPCR方法 青霉素、四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯（如紅微素）和萬古霉素的使用歷史已達(dá)80a之久，不同的抗生素使用年限也有差異。之所以選擇這些抗生素和抑菌劑的抗性決定子并加以對(duì)比，是因?yàn)樗鼈兇聿煌乃幬镱愋?、靶位以及作用方式，并在不同的年代曾?yīng)用于農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域。使用實(shí)時(shí)qPCR進(jìn)行18種ARG和16S rRNA基因豐度的定量測定。盡管不可能對(duì)所有的可能基因加以定量化，但選擇的基因代表了不同的藥物種類，能夠反映不同的抗性機(jī)理。為目標(biāo)抗性基因選擇或指定合適的引物和探針，這些信息總結(jié)在表2（表略）中。參照已發(fā)表的方法進(jìn)行四環(huán)素抗性決定子[tet(B)、tet(L)、tet(M)、tet(O)、tet(Q)和tet(W)]的分析，紅微素抗性甲基化酶決定子[erm(B)、erm(C)、erm(E)、erm(F)]，以及vanA、vanB、mecA、ampC、blaTEM-1、blaCTX-M、blaSHV-1和blaOXA-1的測定均參照已發(fā)表的方法。 探針和引物設(shè)計(jì) 16S rRNA基因分析使用了普適性真細(xì)菌探針和引物，它們也常用于qPCR反應(yīng)中測定微生物總量。根據(jù)前期建立的方法篩選tet決定子、ampC（氮芐青霉素抗性，group-1, class-C ESBL）、vanA（萬古霉素抗性基因）以及blaCTX-M（group 2，class D ESBL）適合的引物和探針，最終使用了TaqMan探針。第2個(gè)萬古霉素抗性基因（vanB）參照Palladino等的方法，并加以修改。對(duì)NCBI GenBank網(wǎng)站上的BLASTn檢索并以細(xì)微修改以增加分析的普適性；用VanB-FL探針序列替代原有的正義引物，將VanB-640結(jié)合到TaqMan探針之中，而反義引物（VanBR）則保持不變。甲氧西林抗體（mecA）分析包括Rieschl等發(fā)現(xiàn)的正義引物、TaqMan以及Tan等發(fā)現(xiàn)的反義引物。 本研究依然采用了文獻(xiàn)中發(fā)表的正義和反義引物，但對(duì)Erm決定子進(jìn)行了修改使其適應(yīng)qPCR的需要，降低擴(kuò)增子的長度（通常小于200bp）。然而，根據(jù)Primer3軟件及聯(lián)合GenBank序列的結(jié)果我們還設(shè)計(jì)了其他的引物。利用BLASTn軟件測試引物的特異性，隨后在不同的退火溫度下通過試驗(yàn)檢測所有引物的反應(yīng)。 在文獻(xiàn)發(fā)表的2種通用引物blaTEM-F和5’-GGAATAAGGGCGACA的基礎(chǔ)上構(gòu)造出了blaTEM，將之作為反義引物。在blaTEM-1和blaTEM-2序列及Primer3軟件的基礎(chǔ)上進(jìn)行引物篩選。根據(jù)最近的BLASTn檢索結(jié)果，對(duì)選擇的blaTEM引物對(duì)的通用性加以測定，發(fā)現(xiàn)包括1~3、6、10、12、21、22、26、54、60、67、70-72、77~84、89、104~107、109、128~129、131、138、144、150~152、158、162和163等TEM-變量。blaSHV（blaSHV-F和blaSHV-R）的引物利用相類似的方法加以構(gòu)建；對(duì)其通用性加以檢測，它主要包括1~2、5、7、11~14、18、25~26、28、30~31、36~37、42、55~56、59~66、69~71、73~83、89、93~96和104。blaOXA-1的目標(biāo)物為blaOXA的第1簇；正義引物是Moland發(fā)現(xiàn)的反義引物的反向互補(bǔ)序列以及未經(jīng)改變過的反義引物。使用的GenBank序列包括AY008291、J02967、EF415651、EU117233和AF227505，其分析的標(biāo)的物是blaOXA-4和blaOXA-30。 qPCR方法 反應(yīng)條件。DNA模板（2μL）、合適的引物、TaqMan探針與iQ supermix PCR試劑、分子級(jí)水混合起來，體積為25μL。在配有iQ熒光檢測器、2.3版本軟件的BioRad iCycler中開始反應(yīng)。溫度循環(huán)方式為95℃（10min）、94℃循環(huán)40~45次（20s），隨后為退火及延伸條件（見表2，表略）。所有樣品重復(fù)2次，任何樣品出現(xiàn)較大的偏差（較高的分析差異）都將重新分析。平行樣品的差異在±0.3（對(duì)數(shù)比例）以內(nèi)。很多情況下，常檢測TaqMan探針、雙重標(biāo)記的具有5’-熒光團(tuán)和3’-淬火團(tuán)的寡核苷酸。除此之外，SYBR-green I、非特異性熒光染料也可用于檢測，隨之繪制溫度溶化曲線來確保反應(yīng)質(zhì)量（50~95℃，ΔT =0.1℃/s）。 所有反應(yīng)都需要用梯度稀釋的已知量的質(zhì)粒-DNA標(biāo)準(zhǔn)品（用革蘭氏陽性菌制作）加以檢驗(yàn)。向樣品中添加已知量的模板，對(duì)比該混合樣品與對(duì)照樣品在濃度臨界值（CT）上的差異（通常小于1個(gè)循環(huán)的差異），判斷樣品中是否有某種抑制物質(zhì)。用分子級(jí)水按照1:100（點(diǎn)位A和B）或1:1 000（點(diǎn)位C-E）將其稀釋能夠很好地減弱抑制物質(zhì)的影響。另外，為了檢測是否有抑制物質(zhì)，可以對(duì)比某些樣品（指的是那些具有較高DNA濃度的樣品）梯度稀釋溶液和質(zhì)粒對(duì)照樣品的PCR效率（通常處于75%~110%）。所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)都高于0.990，對(duì)數(shù)基因豐度值也處于標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍之內(nèi)。 數(shù)據(jù)分析 ARG豐度需要對(duì)16S rRNA基因豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以減弱不同提取過程和分析效率引起的分析偏差，縮小背景微生物豐度的差異。這就在每個(gè)采樣點(diǎn)位生成了一系列時(shí)間序列的相對(duì)ARG值。利用這些數(shù)據(jù)結(jié)合不同的回歸模型（如線性、指數(shù)或冪函數(shù)），可以評(píng)價(jià)出各種基因隨著時(shí)間的變化趨勢(shì)，殘差和決定系數(shù)（R2）可以用于選擇最佳模型。在時(shí)間序列中指數(shù)函數(shù)的擬合效果最好。 在長期趨勢(shì)分析中（即從1940~2008年），采用了幾種不同的方法來整合不同的時(shí)間序列，最后得出結(jié)論，當(dāng)所有時(shí)間序列都有數(shù)據(jù)時(shí)，可以使用最小偏差法將所有“ARG與16S rRNA的比值”整合于某一個(gè)時(shí)間窗（即20世紀(jì)70年代中期）的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，因此每一種ARG在1970~1979年的平均值就被賦予值1.0，而1970~1979年時(shí)間段之前和之后的單位ARG水平則通過比例變化加以計(jì)算。這個(gè)整合過程將不同時(shí)間段的監(jiān)測結(jié)果統(tǒng)一起來，消除了每個(gè)采樣點(diǎn)位在土壤類型或其他條件上的不同所導(dǎo)致的背景ARG和16S rRNA基因水平的差異。整合后的數(shù)值用于測定某種基因的長期變化趨勢(shì)，以及某種抗生素類別下所有檢測基因的總體趨勢(shì)。后面一個(gè)步驟是非常有價(jià)值的，因?yàn)樗軌驅(qū)⒉煌瑫r(shí)間段的數(shù)據(jù)集中起來，增加不同趨勢(shì)預(yù)測的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果和討論 選用了5個(gè)土壤系列進(jìn)行測試，是因?yàn)樗鼈儚亩?zhàn)結(jié)束至今均經(jīng)歷了抗生素的大批量生產(chǎn)，在這段時(shí)期內(nèi)，20世紀(jì)70年代末荷蘭改進(jìn)了對(duì)廢物處理的程序，并且過去的10年非治療性抗生素在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的使用越來越受限制。圖1和表1概述了這些土壤的位置和類型、水資源、有機(jī)肥的施用水平以及樣品采集后所保存的時(shí)間，這些特征在不同的土壤系列中略有不同。本研究也考慮了其它點(diǎn)位檔案土壤，它們可能能夠代表更長的時(shí)間窗口，然而，我們最后選擇僅關(guān)注TAGA的檔案土壤，因?yàn)樗鼈兊奶幚砗蛢?chǔ)存方法比較明確且均一。 在所有土壤樣品中，每克土壤（干重）中的16S-rRNA基因含量處于108~1 010，上層土壤更是如此。為了測試土壤樣品退化的可能性，對(duì)每個(gè)系列的土壤中16S-rRNA含量值的對(duì)數(shù)隨時(shí)間的變化進(jìn)行了線性回歸分析。然而，在檔案土壤樣品中并未觀察到每克干土中16S-rRNA含量水平隨時(shí)間有顯著的變化（r2<0.48，p>0.13）。因此，雖然其他研究指出檔案土壤儲(chǔ)存過程中可能伴隨這土壤的污染或DNA降解，本研究并未發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象。 計(jì)算了5個(gè)采樣點(diǎn)位每種抗生素的單一基因及所有基因的ARG相對(duì)于16S-rRNA的相對(duì)豐度（標(biāo)準(zhǔn)化）（包括每個(gè)采樣點(diǎn)位中每個(gè)土壤樣品的絕對(duì)及相對(duì)基因豐度）。在ARG隨時(shí)間變化的首次評(píng)價(jià)中，標(biāo)準(zhǔn)化的某種ARG隨時(shí)間的變化用指數(shù)模型模擬，來測定每一點(diǎn)位基因的總體變化趨勢(shì)。盡管只有31%的速率系數(shù)具有統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性（p<0.10），但有78%（64中的50個(gè)）的標(biāo)準(zhǔn)化單一ARG隨著時(shí)間的推移逐漸增加。然而，有4個(gè)點(diǎn)位的標(biāo)準(zhǔn)化單一ARG水平，即點(diǎn)位C的所有系數(shù)為正，而點(diǎn)位A、E和D都具有3個(gè)以下的負(fù)系數(shù)。事實(shí)上，只有點(diǎn)位B的標(biāo)準(zhǔn)化相對(duì)ARG水平?jīng)]有明顯增加。此外，測定的主要類別的抗生素抗性基因的含量都隨著時(shí)間的推移而逐漸增加，其中四環(huán)素抗性基因含量的增加更加頻繁地表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)意義上的顯著。 雖然這些結(jié)果提供了一些信息，并大致表明ARG水平隨時(shí)間增加而增加，但是它們并沒有描述出ARG含量的長期變化趨勢(shì)，因?yàn)槊恳粋€(gè)土壤系列代表了不同的時(shí)間段。因此，這些標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)值被整合為1970~1979年測定數(shù)值的平均值，5個(gè)點(diǎn)位的時(shí)間序列都包括這個(gè)時(shí)間段。這一方法為1940~2008年每種ARG及ARG種類提供了一個(gè)綜合的時(shí)間序列，雖然不同點(diǎn)位具有不同的背景土壤和其它條件，這種方法允許對(duì)不同點(diǎn)位的長期變化趨勢(shì)加以對(duì)比。對(duì)整合數(shù)據(jù)（概括了所有點(diǎn)位的ARG檢測數(shù)據(jù)，包括點(diǎn)位B）的趨勢(shì)加以總結(jié)，結(jié)果顯示從1940年以來ARG豐度呈現(xiàn)出顯著增加的趨勢(shì)。這些趨勢(shì)適用于所有類別的被測抗生素，并且這與每塊點(diǎn)位標(biāo)準(zhǔn)化基因的變化趨勢(shì)，以及基于整合ARG數(shù)據(jù)計(jì)算出的單一基因的長期變化趨勢(shì)都較為吻合。 該結(jié)果進(jìn)一步表明，包含ARG的土著細(xì)菌的相對(duì)比例隨時(shí)間變化而顯著增加，與1970~1979年時(shí)的水平相比，2008升高了2~15倍。值得注意的是其顯示出比點(diǎn)位標(biāo)準(zhǔn)化基因變化趨勢(shì)（p<0.05）更高的統(tǒng)計(jì)顯著水平，這可能是因?yàn)樗俾氏禂?shù)是在更大的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)之上進(jìn)行估算的。在單一ARG中，標(biāo)準(zhǔn)化的和整合的ARG豐度增加速率最快的是四環(huán)素[尤其是tet(Q)、tet(O)和tet(M)]以及β-內(nèi)酰胺酶blaTEM-1。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)了CTX-M系列中超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的升高（即blaCTX-M-1，見表S3），這比臨床中遇到blaCTX-M-1問題的時(shí)間還要早，這表明抗性的決定子可能來源于土壤，這與我們前期的推測是一致的。 大部分被測ARG的豐度隨時(shí)間變化而增加，而不同的基因和點(diǎn)位間依然存在著差異，這對(duì)了解某些特定點(diǎn)位中影響抗性基因長期保持的主要因子具有十分重要的參考價(jià)值。相應(yīng)地，我們?cè)u(píng)價(jià)了多種“本地的”因素，包括土壤重金屬濃度、土壤的吸附作用和排水特征、有機(jī)肥或其它化肥的施用水平、不同的灌溉方法，抑或是其他沒有考慮到的因素。例如，測定了土壤重金屬的含量，以確定在特定土壤中抗生素抗性的提高是否是由于已經(jīng)存在的重金屬導(dǎo)致的。然而長達(dá)68年的樣品記錄顯示，土壤重金屬濃度并未顯著增加。實(shí)際顯示在1940年到20世紀(jì)60年代末之間在金屬濃度增加的同時(shí)ARG濃度也在增加，但此后金屬濃度下降而綜合ARG最大的趨勢(shì)最大。 由于歷史資料有限，我們的研究僅僅是定性分析，但是土壤類型、灌溉水源和類型、以及肥料使用等方面的差異在一定程度上可以暗示出影響ARG時(shí)空變化的主要因素。土壤樣品采集時(shí)的目的并非開展本研究，點(diǎn)位上使用的其它化學(xué)物質(zhì)、肥料應(yīng)用的模式、灌溉水的水質(zhì)和用量等重要的數(shù)據(jù)，或沒有記錄或已不可知。無論如何，做一些推論是可以的。例如，如果將1986年以前3個(gè)點(diǎn)位樣品的ARG濃度加以比較，點(diǎn)位A和點(diǎn)位C的相對(duì)ARG濃度大致呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，而點(diǎn)位B則沒有。盡管這3塊點(diǎn)位均接受灌溉水和肥料，但只有點(diǎn)位B的土壤是排水性能較好的沙質(zhì)土，灌溉水也沒有受到污染。作為背景參照點(diǎn)，點(diǎn)位A和點(diǎn)位C長期受到鹽水入侵的侵?jǐn)_，因此它們一直需要來自艾塞爾湖的淡水進(jìn)行灌溉，而在20世紀(jì)80年代前艾塞爾湖水就受到生活垃圾和其它垃圾的嚴(yán)重污染。相反，盡管肥料施用記錄不系統(tǒng)，但點(diǎn)位C有機(jī)肥的施用量比點(diǎn)位A和點(diǎn)位B高出近10倍。因此，基因的數(shù)據(jù)顯示，很明顯的一條結(jié)論是灌溉水水質(zhì)（灌溉水和背景鹽水）和土壤排水性能可能比有機(jī)肥的施用更加重要，這與我們最初關(guān)于有機(jī)肥作用的假設(shè)相反。大量的證據(jù)表明，有機(jī)肥的施用會(huì)向土壤中引入ARG；然而在研究長期影響時(shí)，灌溉水水質(zhì)和排水似乎顯得更加重要，這需要進(jìn)一步的研究加以確認(rèn)。 環(huán)境保護(hù)正在逐漸改善，那么為什么ARG水平仍然在升高？在我們的研究中，荷蘭的某些特定的行為可能是這個(gè)問題的答案，盡管在世界上這樣的地域性活動(dòng)并不罕見。例如，盡管一再強(qiáng)調(diào)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中盡量不要使用抗生素，但1997年以來荷蘭對(duì)抗生素的使用呈現(xiàn)出驚人的增長速度。在歐洲較為嚴(yán)格的制度的控制之下，荷蘭出現(xiàn)這種現(xiàn)象的真正原因仍處在爭論之中；然而，這種增長與點(diǎn)位D和點(diǎn)位E土壤中ARG水平的升高如出一轍，四環(huán)素更是如此。不論原因如何，近年來ARG水平的升高只不過是土壤中抗性基因明顯增高這一現(xiàn)象的延續(xù)。回顧過去可以發(fā)現(xiàn)，不同的因素在不同的歷史時(shí)期會(huì)顯得格外重要或沒那么重要，包括重金屬污染、污染地表水的灌溉、海水入侵以及農(nóng)業(yè)中抗生素使用量的增加等。總體上而言，我們的研究表明單一的修復(fù)方法不可能成功地減弱抗生素抗性增加這一趨勢(shì)，這就需要能夠同時(shí)針對(duì)多種原因的全面戰(zhàn)略，在抗生素大量生產(chǎn)仍在繼續(xù)的情況下更是如此。 本研究展示出了荷蘭土壤中抗性逐漸增加這一趨勢(shì)，研究結(jié)果也意味著在世界范圍內(nèi)開展更多的類似的研究。例如，本研究結(jié)果表明，我們可能遇到對(duì)抑菌劑療法具有抗性的生物體的幾率將日漸增高。隨著遺傳物質(zhì)的水平交換以及細(xì)菌宿主多樣化的增加，環(huán)境中的或共生生物體中的每一種潛在的外源抗性基因都會(huì)使病原菌獲得抗性的機(jī)會(huì)大大增加。此外，由于土壤可以作為對(duì)土著微生物有益決定子的儲(chǔ)蓄場所，即使將來抑菌劑的使用越來越謹(jǐn)慎，過去某個(gè)時(shí)段的抗生素和抑菌劑的暴露都可能對(duì)抗性基因庫有著無法磨滅的影響，當(dāng)然還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證?？傮w而言，本研究的數(shù)據(jù)表明目前還沒有完全篩選出促進(jìn)抗生素抗藥性升高的環(huán)境因子，這就需要對(duì)抗生素抗藥性、環(huán)境及人為因素的相互關(guān)聯(lián)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。國家醫(yī)事委員會(huì)的報(bào)告“通往最小抗性之路”中說，“現(xiàn)在有一種不安的感覺，微生物種類越來越多，而治療的方法的卻越來越少”，本研究的結(jié)果也顯示，土壤微生物逐漸增強(qiáng)的抗性可能會(huì)成為一個(gè)新的難題，它將對(duì)人類與全球抗生素抗藥性間戰(zhàn)爭形成新的沖擊。 張長波 譯自Evidence of Increasing Antibiotic Resistance Gene Abundances in Archived Soils since 1940. 《Environmental Science & Technology》, 2010, January, 15: 580~587.
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