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| 購(gòu)買(mǎi)進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 m.kjhfd.cn |
前言：現(xiàn)在數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)于原代細(xì)胞培養(yǎng)的文章文獻(xiàn)數(shù)不勝數(shù)，但是令人遺憾的是，其中沒(méi)有一篇是很詳盡的說(shuō)明原代培養(yǎng)的方法，沒(méi)有一個(gè)有解答出為什么要這樣做. 為了讓大家少走彎路，根據(jù)我殺過(guò)3000只老鼠的經(jīng)驗(yàn)，我把我這幾年摸索的經(jīng)驗(yàn)和大家分享，請(qǐng)求多投幾票得幾個(gè)叮當(dāng)。相信你follow我的這篇文章一定會(huì)做的很好。 我的標(biāo)題說(shuō)的很像吹牛，但是我是嚴(yán)肅認(rèn)真的說(shuō)的，I earn it. note:這篇文章全是我個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)，99。9%原創(chuàng)，經(jīng)過(guò)無(wú)數(shù)失敗的到的最完美的原代神經(jīng)元培養(yǎng)法，除了最后那一副圖是來(lái)自下面第2行那篇文獻(xiàn)，所以我才說(shuō)是99.9%原創(chuàng)。 (注：附錄的圖是常用的消化酶對(duì)實(shí)驗(yàn)的存活率影響，來(lái)自下面鏈接里的文獻(xiàn))另外，成年鼠的原代培養(yǎng)我沒(méi)有摸索過(guò)，推薦一篇文獻(xiàn)在我以前的帖子(無(wú)需叮當(dāng))(http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=156&id=17651341&sty=3) 本篇專門(mén)討論胎鼠和新生鼠神經(jīng)元的原代培養(yǎng)。 1.材料選擇。一定要嚴(yán)格按照國(guó)際上，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，其他文獻(xiàn)的材料一致。胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。因?yàn)樾律笥幸恍┦荏w，在培養(yǎng)的工作中失去功能，會(huì)不能再生，比如NMDA受體。和文獻(xiàn)不同會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)論，甚至困惑。很多人寫(xiě)信問(wèn)我新生鼠的培養(yǎng)問(wèn)題，我回答用新生鼠的實(shí)驗(yàn)很少，八成是你自己搞錯(cuò)了實(shí)驗(yàn)對(duì)象，請(qǐng)確認(rèn)國(guó)際上的相關(guān)研究文獻(xiàn)所用老鼠，再來(lái)問(wèn)我下面的問(wèn)題。 2，培養(yǎng)基選擇(neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。我強(qiáng)烈不建議用血清培養(yǎng)。原因是： 首先，血清刺激膠質(zhì)細(xì)胞和雜細(xì)胞分裂，最后非常影響神經(jīng)元產(chǎn)量; 其次，為了抑制膠質(zhì)生長(zhǎng)，往往要加入阿糖孢苷。嚴(yán)重的毒性會(huì)影響許多靈敏實(shí)驗(yàn); 再次，最重要的，血清培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)很不均一，從正常到凋亡都有，嚴(yán)重影響試驗(yàn)準(zhǔn)確，而無(wú)血清專用培養(yǎng)基所有的正常細(xì)胞都處于一樣的狀態(tài)，要么都好，要么都差，高度一致。 Invitrogen/GIBCO 無(wú)血清培養(yǎng)基neurobasal(neurbasal-A)被認(rèn)為是最標(biāo)準(zhǔn)，最好的培養(yǎng)基。需要的添加劑為 B27和谷氨酰胺。培養(yǎng)出的細(xì)胞狀態(tài)均一，膠質(zhì)細(xì)胞幾乎不分裂。其中，neurobasal是胎鼠培養(yǎng)基，而-A為新生鼠培養(yǎng)基。不過(guò)根據(jù)筆者實(shí)驗(yàn)，沒(méi)什么太大區(qū)別，都能很輕松培養(yǎng)成功，但是，切忌中途換培養(yǎng)基，要從一而終。很多實(shí)驗(yàn)室是不加抗生素的，也有的實(shí)驗(yàn)室加。由于很多初學(xué)者操作不熟練，不注意，很多人會(huì)污染，所以我還是建議加雙抗。 注意!由于無(wú)血清培養(yǎng)基添加劑不是血清，而是人工合成的B27(也有用N2的，但是推薦B27，只差10美金)，血清有復(fù)雜的解毒作用而B(niǎo)27沒(méi)有，雙抗對(duì)細(xì)胞的干擾，無(wú)血清培養(yǎng)基要大的多。所以，如果你在neurobasal里添加抗生素，記得用量只要標(biāo)準(zhǔn)量的一半。 另一個(gè)添加成分谷氨酰胺溶液不穩(wěn)定，所以每次用時(shí)候要現(xiàn)配現(xiàn)加。大概是0.5-2mmol/l大部分人用0.5mmol/l.雖然筆者試過(guò)，沒(méi)加這個(gè)也正常生長(zhǎng)，但是幾乎所有文獻(xiàn)都添加，we just simply follow. 3.解剖過(guò)程一定要全程在冰上遇冷。這就意味著，從你處死母鼠后，胎鼠的大腦的溫度要最快的降低到0度。另外，在解剖過(guò)程中，胎鼠直到皮層或海馬被剪碎的過(guò)程，有時(shí)候可能需要2小時(shí)，如果樣品多。一定要注意多準(zhǔn)備冰袋子。確保你的任何過(guò)程都在冰浴的培養(yǎng)液中進(jìn)行(消化步驟除外)。這樣可以大大提高存活率。在解剖大腦時(shí)候，有人用hank's，在其中解剖。根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，即使是0度，神經(jīng)元還是在進(jìn)行著很大程度代謝。所以，hanks的無(wú)糖環(huán)境很不利。我個(gè)人建議，用DMEM-高糖或DMEM-F12+馬血清來(lái)浸泡解剖過(guò)程中的大腦，來(lái)供給大腦的代謝，血清可以抑制神經(jīng)凋亡。這其中還有一個(gè)問(wèn)題，就是DMEM培養(yǎng)液會(huì)在空氣中變堿性。國(guó)外有的實(shí)驗(yàn)室用L-15培養(yǎng)液來(lái)浸泡解剖過(guò)程中的腦，因?yàn)長(zhǎng)-15不會(huì)再空氣中變堿性。沒(méi)有L-15的(國(guó)內(nèi)幾乎沒(méi)有)，可以全程用DMEM-HG或者DMEM-F12+血清浸泡解剖過(guò)程中的腦。注意注意：一切操作都在冰浴的液體中，所以要多準(zhǔn)備冰袋。(中途冰袋沒(méi)了的是豬頭) 4.關(guān)于培養(yǎng)皿的問(wèn)題。一般來(lái)說(shuō)，6孔板是最佳選擇。神經(jīng)元讓人苦惱的問(wèn)題是，神經(jīng)元發(fā)育的情況和密度相關(guān)。大于6孔板(比如6CM DISH)會(huì)使得中間很難和周?chē)募?xì)胞密度一樣，造成板中間和邊緣成熟度不一樣，而這會(huì)給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)很大干擾。而太小的話(96孔或128孔)細(xì)胞會(huì)傾向于向中間集中也會(huì)照成發(fā)育不均勻。所以筆者經(jīng)驗(yàn)是6孔板是最佳選擇。神經(jīng)原代培養(yǎng)一定是要包被，用POLY-LYS或者膠原。 關(guān)于POLY-LYS包被，我們是包被30分鐘，吸干晾過(guò)夜，然后洗兩次，或者只洗一次但是要30分鐘接著晾干。由于neurobasal培養(yǎng)法相當(dāng)成熟，所以沒(méi)必要用難固定的膠原。 5.處死母鼠并把胎鼠解剖時(shí)候，一定要注意母鼠狀態(tài)，是否有死胎，胎兒胎盤(pán)是不是正常，有多少胎，母鼠是多少天的(一般是E16-E18)這些信息也要嚴(yán)格記錄。處死孕鼠后，要立即取出子宮放入冰冷培養(yǎng)液中。注意孕鼠處死后要短暫的浸泡酒精消毒，防止污染。 一般來(lái)說(shuō)，冰袋筆者選擇一面藍(lán)一面白的。藍(lán)的朝上，可以很清晰看到海馬結(jié)構(gòu)。而去除血管膜的時(shí)候，白的那面朝上，這樣可以很清楚看到血管膜。 從處死老鼠到大腦被剝離出這段是人就會(huì)做，我就不多說(shuō)了。不過(guò)有一點(diǎn)要注意，不管你是用皮層還是海馬，不要取一個(gè)分離一個(gè)，而是要快速把所有胎鼠大腦都迅速取出放到冰預(yù)冷的培養(yǎng)液中。我建議胎鼠取出來(lái)的時(shí)候胎鼠就放在冰冷的緩沖液中。就是說(shuō)，處死后要迅速把大腦的溫度降到0. 6：最影響原代培養(yǎng)的成敗因素之一：這小段請(qǐng)大家一定注意看。無(wú)論皮層還是海馬，上面都是有一層血管膜。注意：一定要盡可能的去掉所有的血管和血管膜?？梢杂媒馄曙@微鏡。胎鼠很好剝離，而新生鼠則比較難。這里千萬(wàn)不能粗心大意!!血管膜沒(méi)剝離干凈的后果是：1 吹打時(shí)候很難吹打下來(lái)神經(jīng)元，被迫多次吹打，造成神經(jīng)元大量死亡;2 血管膜一部分細(xì)胞會(huì)混入原代培養(yǎng)中，這些細(xì)胞往往會(huì)分裂，導(dǎo)致你的培養(yǎng)成果根本不能用。可以說(shuō)，剝離的不好不干凈，實(shí)驗(yàn)就是失敗的，不可能得到高質(zhì)量的神經(jīng)元。 注意的事情二：如果是要的是皮層的神經(jīng)元原代培養(yǎng)，而皮層的細(xì)胞很多，切忌不要放太多皮層消化吹打!過(guò)多的細(xì)胞反而會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元大量死亡。另外，請(qǐng)仔細(xì)注意文獻(xiàn)中要的是皮層哪一部位。沒(méi)有詳細(xì)要求的話一般是取頂端。 從大腦到單個(gè)海馬的剝離我不細(xì)說(shuō)了。我現(xiàn)在以海馬神經(jīng)元為例。在所有海馬都成功剝離后，請(qǐng)仔細(xì)的去除血管膜，原因上面說(shuō)過(guò)。最后，請(qǐng)?jiān)僮屑?xì)檢查一下是不是都去掉了。確認(rèn)后，海馬片段被移入一個(gè)小燒杯里，加少量培養(yǎng)液，用剪刀剪成0.5-1立方毫米的小塊，放置冰上準(zhǔn)備消化， 7：實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵之二：消化。一般來(lái)說(shuō)，我看很多人都用0.125%的胰酶消化。實(shí)話說(shuō)，胰酶消化非常的難以掌握速度，而且消化效果真的是--很爛!稍微不注意，就會(huì)消化過(guò)頭，細(xì)胞都消化光了。而胰酶消化的快，還會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞快速破裂釋放出DNA，和其他蛋白纏結(jié)成絮狀包裹在組織塊外面，使得塊里面的不到應(yīng)有的消化。所以我個(gè)人不推薦胰酶。 想做一個(gè)完美成功的消化，我強(qiáng)烈推薦木瓜酶+DNA酶。木瓜酶是消化過(guò)后，存活率最高的酶(見(jiàn)附圖)。筆者是配成2mg/ml的木瓜酶。另外要用的是DNA酶。DNA酶的作用是，消化掉破裂細(xì)胞的DNA，避免了釋放的DNA和蛋白纏結(jié)在組織塊表面而阻礙進(jìn)一步消化。DNA酶由于各個(gè)公司的活性不一樣，很難有標(biāo)準(zhǔn)濃度，需要摸條件，不過(guò)不是很?chē)?yán)格，只要能防止DNA纏結(jié)就好。 木瓜酶的特點(diǎn)是不會(huì)消化過(guò)頭，非常溫和。缺點(diǎn)是一定要現(xiàn)配(請(qǐng)直接用無(wú)血清的培養(yǎng)液配來(lái)保證神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)代謝，而且一定要現(xiàn)用現(xiàn)配。 消化的技巧：消化時(shí)候，很多人有不良習(xí)慣，喜歡用個(gè)50ml試管裝著所有東西。結(jié)果是組織都沉底，下面消化不足，上面消化的沒(méi)細(xì)胞。筆者的技巧是，用一個(gè)6或10CM 培養(yǎng)皿來(lái)消化。這樣消化液在培養(yǎng)皿里形成淺而廣闊的一層，均勻分布著組織塊，從而徹底解決了上述問(wèn)題。消化酶是2mg/ml木瓜蛋白酶+適量DNA酶。木瓜蛋白酶很便宜請(qǐng)放心。消化過(guò)程是20-30分鐘。由于木瓜蛋白酶溫和，因此不會(huì)消化過(guò)頭，使得你的實(shí)驗(yàn)消化的很穩(wěn)定。消化時(shí)候請(qǐng)?jiān)?7度溫箱里，每5分鐘稍微搖動(dòng)一下。 注意：1)木瓜酶不要用巰基化合物激活，激活后消化好很多但是成活率壞很多;2)盡量用不含血清的培養(yǎng)液來(lái)配置木瓜酶而不是用hanks，使得神經(jīng)元保持營(yíng)養(yǎng);3)木瓜酶一定要現(xiàn)用現(xiàn)配。 再次重申：除了消化過(guò)程中要37度，其余任何時(shí)刻都是要浸泡在0度(冰浴)的液體中。消化過(guò)后可以用1ml血清終止反應(yīng)(我是用馬血清，便宜，但是切忌不要用國(guó)產(chǎn)血清，污染幾率很大)。把消化用的培養(yǎng)皿放在冰上冷卻，然后墊高一面使得液體集中在另外一面便于吹打。整個(gè)體系靜止2-3分鐘，然后仔細(xì)的去掉上層的液體，保留消化過(guò)的組織塊 8.實(shí)驗(yàn)成敗最關(guān)鍵最關(guān)鍵的：吹打。筆者經(jīng)驗(yàn)是，沒(méi)有必要用巴斯德管。對(duì)于胎鼠和10天之內(nèi)的新生鼠，一般的1ml藍(lán)槍頭就可以達(dá)到滿意的效果。在一邊被墊高的皿里面，加入1-1.5ml新鮮培養(yǎng)基和少量DNA酶，吹打10次。吹打時(shí)候要注意，切忌過(guò)快，要緩慢吹打。吸入時(shí)候要很緩慢，吹出的時(shí)候可以略快，但是也要緩慢。輕柔吹打是細(xì)胞成活關(guān)鍵!要用進(jìn)口槍頭，國(guó)產(chǎn)的有時(shí)候會(huì)過(guò)細(xì)。 我們采用的是最合理的分步吹打法。每個(gè)10次吹打過(guò)后，靜止2分鐘。這時(shí)候游離的單細(xì)胞在上面，而團(tuán)塊會(huì)沉到下面去。上面的那層就是你要的單個(gè)懸浮細(xì)胞，把它們挪到指定容器里(一樣要冷在冰上)。下面沉淀下去的細(xì)胞團(tuán)塊不要丟棄，再加1-1.5ml新鮮培養(yǎng)液，重復(fù)剛才的步驟，輕柔吹打，再靜止2分鐘，轉(zhuǎn)移上層的單細(xì)胞到剛才指定容器里，一共這樣分步吹打3次。3次之后如果還有團(tuán)塊在下面，請(qǐng)果斷丟棄。造成這個(gè)的原因就是剛才的血管膜沒(méi)剝好。這個(gè)分步吹打的過(guò)程保證了每一個(gè)單細(xì)胞都避免了過(guò)度吹打，而分布吹打又保證了盡可能多的收獲單細(xì)胞。重申一下，為了保證最大程度收獲活細(xì)胞，每次吹打之前，可以加入少量DNA酶。這招可以更容易收獲大量高質(zhì)量細(xì)胞，尤其是實(shí)驗(yàn)材料不足時(shí)候。消化和吹打非常忌諱操作的細(xì)胞過(guò)多，這樣反而會(huì)使大量細(xì)胞死亡。實(shí)驗(yàn)者如果是用的皮層這種原材料充足的話，切忌不要放入過(guò)多皮層。 9(可選可不選，但是我建議全選)神經(jīng)元進(jìn)一步純化。 一般來(lái)說(shuō)，收獲的細(xì)胞懸液已經(jīng)是很純的神經(jīng)細(xì)胞了。但是，由于實(shí)驗(yàn)者等個(gè)人或者客觀原因，血管膜可能不會(huì)被完全剝離;雜細(xì)胞可能也被吹入了細(xì)胞懸液;操作者手法不熟練，造成死細(xì)胞過(guò)多，影響種板等等原因，還是會(huì)影響到培養(yǎng)的神經(jīng)元的質(zhì)量。為了克服這些，筆者查了一些文獻(xiàn)，經(jīng)過(guò)反復(fù)測(cè)試采用了nycoprep低轉(zhuǎn)速密度-梯度離心?，F(xiàn)在這個(gè)梯度溶液已經(jīng)被公司升級(jí)為optiprep.稀釋時(shí)候，NycoPrep™ 1.077 推薦稀釋成 60%，就用剛才懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液來(lái)配置。注意：1.077被廣泛應(yīng)用于血液中分離血細(xì)胞，如果你拿到的nycoprep(optiprep)不是1.077，那么請(qǐng)換算一下稀釋度)值得注意的是，皮層和海馬可能需要的稀釋度稍微有不同。一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)10ml梯度離心管中，2-4ml稀釋過(guò)的梯度液體就夠用，取決于你收獲的細(xì)胞量多少。把你收獲的細(xì)胞懸液小心的加到稀釋好的梯度劑的上面一層，經(jīng)過(guò)1500轉(zhuǎn)(不是15000請(qǐng)注意)5-8分鐘，神經(jīng)元被高度壓縮到梯度面和上面的培養(yǎng)液分界面那一層。而最下面的梯度劑下的沉淀則是細(xì)胞團(tuán)塊，血細(xì)胞，雜細(xì)胞，以及部分小膠質(zhì)細(xì)胞。而最上層最浮頭，則是細(xì)胞碎片。這樣，你就得到了最大限度去除了雜細(xì)胞，和細(xì)胞碎片，并去掉了一定的膠質(zhì)細(xì)胞的最干凈最純粹的神經(jīng)元。如果實(shí)驗(yàn)者技術(shù)精湛，也可以不用這步，但是用這步會(huì)效果更好。注意：母液稀釋到60%只是參考，具體實(shí)驗(yàn)室不同可能略微有差別，要摸條件而不是死記硬背。另外皮層和海馬濃度也稍微有差別。有些文獻(xiàn)曾經(jīng)報(bào)道，在梯度一定的情況下，一些特定梯度可以分開(kāi)神經(jīng)元和少突和其他膠質(zhì)細(xì)胞，但是筆者從來(lái)沒(méi)成功過(guò)。 10.種板。這一步?jīng)]有那么非常重要，但是如果沒(méi)認(rèn)真弄，濃度的不均一也會(huì)使得整個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗。記住的是，神經(jīng)元原代培養(yǎng)是細(xì)節(jié)決定成敗，任何一個(gè)環(huán)節(jié)沒(méi)處理好，整個(gè)實(shí)驗(yàn)都會(huì)失敗。 種板密度過(guò)低是非常有害的。首先，神經(jīng)元互相接觸的幾率小，難以存活和成熟。其次，膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)大量分裂，導(dǎo)致神經(jīng)元變得更少，從而得到失敗的實(shí)驗(yàn)。 密度過(guò)高也是很有害的。由于營(yíng)養(yǎng)爭(zhēng)搶，密度過(guò)高有可能導(dǎo)致局部細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)枯竭死亡。另外，高密度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞聚團(tuán)，結(jié)果也是細(xì)胞不正常形態(tài)或者死亡，導(dǎo)致錯(cuò)誤或失敗的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 筆者的經(jīng)驗(yàn)是6孔板每一個(gè)孔要有7×100000 個(gè)正好(如果是臺(tái)酚藍(lán)染色只記錄活細(xì)胞，那么酌情減少密度)。注意，注意!!由于神經(jīng)元的成熟速度和接種密度有很大關(guān)系，所以細(xì)胞計(jì)數(shù)一定要非常嚴(yán)肅認(rèn)真!!!一定要所有格子都看!!如果發(fā)現(xiàn)計(jì)數(shù)板細(xì)胞不均勻，寧愿重新計(jì)數(shù)!!!由于接觸抑制現(xiàn)象，適當(dāng)密度的神經(jīng)元可以抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)，從而達(dá)到理想的實(shí)驗(yàn) 由于neurbasal培養(yǎng)液相當(dāng)昂貴，所以種板時(shí)候是不用它的，而第一次換液才用。一般種板時(shí)候我們用的是DMEM-HG或者DMEM-F12 +10%馬血清。注意一定要進(jìn)口的。國(guó)產(chǎn)雜質(zhì)很多會(huì)導(dǎo)致莫名其妙的細(xì)胞死亡。馬血清會(huì)抑制神經(jīng)元凋亡并且抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)(FBS也可以，但是太貴) 種板注意事項(xiàng)一：種板時(shí)候的溶液推薦使用含有谷氨酸的培養(yǎng)液。神經(jīng)元的NMDA等谷氨酸毒受體一般3天后才會(huì)出現(xiàn)。所以種板時(shí)候有谷氨酸不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性反應(yīng)。而這時(shí)候的谷氨酸反而是有利條件，可以促使神經(jīng)元貼壁，從而提高存活率。 注意事項(xiàng)二(嚴(yán)格注意)種板后都是要搖晃板搖勻細(xì)胞，切記!千萬(wàn)不能圈圈搖晃!!圈圈搖晃會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元都集中到培養(yǎng)板的孔中間，導(dǎo)致濃度不均，生長(zhǎng)不均勻，會(huì)直接導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。正確的搖法是左右平行翻轉(zhuǎn)角度，然后前后平行翻轉(zhuǎn)角度，千萬(wàn)不要讓里面液體畫(huà)圈! 注意事項(xiàng)三(嚴(yán)格注意)種板后過(guò)過(guò)一定時(shí)間要換成正常標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)神經(jīng)元的neurobasal+b27+谷氨酰胺的無(wú)血清培養(yǎng)液。很多paper是1小時(shí)就換液，理由是膠質(zhì)細(xì)胞貼壁差，會(huì)除去。但是筆者的經(jīng)驗(yàn)來(lái)看，這是極端錯(cuò)誤的!1小時(shí)換液，神經(jīng)元還沒(méi)有完全貼壁，這時(shí)候換液會(huì)吹下很多神經(jīng)元，流到孔另外一側(cè)再貼壁，直接照成一個(gè)孔內(nèi)細(xì)胞分布不均勻，從而成熟的不均勻。嚴(yán)格來(lái)說(shuō)這種事情直接實(shí)驗(yàn)失敗。 筆者的經(jīng)驗(yàn)是種板4-6小時(shí)換液，但是千萬(wàn)不能超過(guò)12小時(shí)。原因是：超過(guò)12小時(shí)，混在細(xì)胞懸液中的大量細(xì)胞碎片也會(huì)牢牢貼壁，而細(xì)胞碎片直接影響神經(jīng)元存活和正常代謝;另外12小時(shí)后，膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)開(kāi)始分裂，這時(shí)候就很難抑制了。筆者推薦是4小時(shí)，但是別超過(guò)8小時(shí)。 注意事項(xiàng)四：4小時(shí)后換液時(shí)，請(qǐng)輕輕搖晃板幾下再換。原因：細(xì)胞碎片貼壁很慢而且不牢固，這時(shí)候的搖晃可以最大程度去掉細(xì)胞碎片。然后，注意：細(xì)胞請(qǐng)?jiān)儆脹](méi)有加血清的，種板時(shí)候用的培養(yǎng)液清洗一次，也是要輕微搖晃，來(lái)進(jìn)一步去除細(xì)胞碎片，從而得到良好的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境。有條件也可以洗兩次，但是筆者覺(jué)得一次足夠。洗了之后吸干液體，換成neurbasal+B27+谷氨酰胺的神經(jīng)元專用無(wú)血清培養(yǎng)基。 對(duì)于原代培養(yǎng)，是細(xì)節(jié)決定成敗，一個(gè)地方不夠好會(huì)滿盤(pán)皆輸，所以請(qǐng)嚴(yán)肅對(duì)待。 (德國(guó)隊(duì)的fans于凌晨) 下面是對(duì)版面一些犯錯(cuò)誤的研究方法中最嚴(yán)重的錯(cuò)誤之一的提醒，請(qǐng)大家注意，我把回帖編輯到這里了。enjoy. 剛回答了一系列形形色色的問(wèn)題，我把這個(gè)問(wèn)題挑明了說(shuō)。 如果您不相信 neurobasal最好的而還是堅(jiān)持用DMEM之類(lèi)的培養(yǎng)液，麻煩檢查一下你們的DMEM或者M(jìn)EM或者DMEM-F12的invitrogen產(chǎn)品序列號(hào)，到網(wǎng)站上檢查下相應(yīng)的組成公式。很多這種培養(yǎng)液都是含有谷氨酸，而且是mmol級(jí)的。 成熟的神經(jīng)元10um的谷氨酸即可照成細(xì)胞凋亡，而谷氨酸受體4-6天就開(kāi)始表達(dá)，如果胎鼠神經(jīng)元經(jīng)歷了mmol濃度的培養(yǎng)液中的谷氨酸還不被毒死，那就是怪事了。 新生鼠不受這個(gè)限制，新生鼠原代培養(yǎng)沒(méi)有有功能的 NMDA受體， 最雷到我的，是板上有人用材料非?；靵y，一會(huì)用胎鼠，一會(huì)用新生鼠，一會(huì)成年鼠的 你們這叫對(duì)自己不負(fù)責(zé)任! we do all cases seriously! 而不是憑借肉眼觀察和猜測(cè)。 做原代培養(yǎng)的，首先就是收集大量背景文獻(xiàn)，看看你的相關(guān)要求的國(guó)際公認(rèn)的做法是用哪種。胎鼠和新生鼠雖然形狀一樣，但是神經(jīng)元的功能一點(diǎn)都不一樣，表達(dá)受體都不一樣。 大部分實(shí)驗(yàn)都是用胎鼠，而新生鼠往往用來(lái)培養(yǎng)測(cè)一些LTD之類(lèi)的(not quite sure,文獻(xiàn)太少)，所以有人問(wèn)我新生鼠的問(wèn)題，我都是說(shuō)你先看下背景文獻(xiàn)是不是你搞錯(cuò)了。 而成年鼠是另外的培養(yǎng)方法，要求更小心仔細(xì)和特別的處理。硬套胎鼠的原代培養(yǎng)必然導(dǎo)致失敗。 另外，在一些藥物保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，不要以為NGF就一定對(duì)神經(jīng)有很大作用，筆者的經(jīng)驗(yàn)是，想要細(xì)胞存活，F(xiàn)GF2是最佳選擇 但是，F(xiàn)GF2會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞變化很大，所以還是別用在原代培養(yǎng)中，不過(guò)成年鼠培養(yǎng)一定要用FGF2。 對(duì)于一些雷到我的，我只能再次說(shuō)，請(qǐng)收集足夠的背景文章在去選擇合適材料，please do it carefully and seriously! 祝大家都能培養(yǎng)出健康漂亮的神經(jīng)元，歡迎大家來(lái)問(wèn)問(wèn)題(如果是美女的話，給個(gè)電話我會(huì)很開(kāi)心) 聲明，除了最后一幅圖是來(lái)自別的文獻(xiàn)，前面所有的經(jīng)驗(yàn)都是我的原創(chuàng)，從無(wú)數(shù)失敗總結(jié)出的我認(rèn)為最完美的神經(jīng)原代培養(yǎng)。 最后，要跟大家提醒一下的是：nycoprep(optiprep)可能會(huì)存在不同的濃度，但是因?yàn)橐郧白畛Ｓ玫腘ycoPrep™ 1.077 ，所以作者默認(rèn)的就是用此溶液配置的密度梯度。如果您使用的不是該密度梯度的，請(qǐng)自行換算一下。
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