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| 購買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 m.kjhfd.cn |
傳代培養(yǎng)，當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時間的延長和細(xì)胞不斷分裂，一則細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面也會因營養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長或發(fā)生中毒。此時就需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)。這個過程就稱為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）。對單層培養(yǎng)而言，80%匯合或剛匯合的細(xì)胞是較理想的傳代階段。
目錄 1 傳代方法 4 主要區(qū)別
1 傳代方法 1．懸浮生長細(xì)胞傳代 離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 2．半懸浮生長細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞） 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。 3．貼壁生長細(xì)胞傳代 2 培養(yǎng)材料
1、無菌磷酸生理緩沖液(Dulbecco’sphosphate-bufferedsaline,Ca++/Mg++free,D-PBS, GibcoBRL21600-010) 2、trypsin-EDTAsolution(0.05%trypsin-0.53mMEDTA-4Na,GibcoBRL25300-062)：以10ml分裝于15ml無菌離心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回溫。 3、新鮮培養(yǎng)基 4、無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶 3 培養(yǎng)步驟
1、附著型胞(adherentcell) ?。?font face="Tahoma">1）吸掉舊培養(yǎng)液。 ?。?font face="Tahoma">2）用D-PBS洗滌細(xì)胞一至二次。 ?。?font face="Tahoma">3）加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37℃作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin作用，離心后再吸掉上清液。 ?。?font face="Tahoma">4）輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。 2、懸浮型細(xì)胞(suspensioncell) ?。?font face="Tahoma">1）吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000rpm5分鐘。 ?。?font face="Tahoma">2）吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。 3、融合瘤(hybridoma) （1）有些hybridomacell需培養(yǎng)三天以上才會產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可能會失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養(yǎng)瓶中。 4 主要區(qū)別
原代培養(yǎng)：即第一次培養(yǎng)，是指將培養(yǎng)物放置在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。有幾方面含義： 1、培養(yǎng)物一經(jīng)接種到培養(yǎng)器皿（瓶）中就不在分割，任其生長繁殖； 2、原代培養(yǎng)中的“代”并非細(xì)胞的“代”數(shù)，因為培養(yǎng)過程中細(xì)胞經(jīng)多次分裂已經(jīng)產(chǎn)生多代子細(xì)胞； 3、原代培養(yǎng)過程中不分割培養(yǎng)物不等于不更換培養(yǎng)液，也不等于不更換培養(yǎng)器皿。 正常細(xì)胞培養(yǎng)的世代數(shù)有限，只有癌細(xì)胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能無限生長下去。所謂轉(zhuǎn)化即是指正常細(xì)胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而具有癌性的細(xì)胞。目前世界上許多實驗室所廣泛傳用的HeLa細(xì)胞系就是1951年從一位名叫Henrietta Lacks的婦女身上取下的宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)而成。此細(xì)胞系一直延用至今。 原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系（株）必經(jīng)的階段，其是否成功與組織污染與否、供體年齡、培養(yǎng)技術(shù)和方法、適宜培養(yǎng)基的選擇等多種因素有關(guān)。由于原代培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化性極小，對病毒敏感性好，因此適應(yīng)制備疫苗等生物制品；但也存在有潛在外源因子、不能事先檢查標(biāo)本、且受供體年齡健康狀況的影響而導(dǎo)致批間差異大等缺陷。目前常用的原代細(xì)胞培養(yǎng)有雞胚成纖維細(xì)胞及豬腎、猴腎、地鼠腎等原代細(xì)胞。 原代培養(yǎng)的基本過程包括取材、培養(yǎng)材料的制備、接種、加培養(yǎng)液、置培養(yǎng)條件下培養(yǎng)等步驟，在所有的操作過程中，都必須保持培養(yǎng)物及生長環(huán)境的無菌。 多數(shù)情況下，分散的細(xì)胞若屬于貼壁依賴型細(xì)胞，就能黏附、鋪展于培養(yǎng)器皿和載體表面生長而形成細(xì)胞單層，這種培養(yǎng)方式稱為單層細(xì)胞培養(yǎng)（monolayer culture），又叫貼壁培養(yǎng)（adherent culture）。少數(shù)情況下，培養(yǎng)的細(xì)胞沒有貼壁依賴性，可通過專門設(shè)備使細(xì)胞始終處于懸狀態(tài)而在體外生長，這種形式稱為懸浮培養(yǎng)（suspension culture）。如何讓接種的細(xì)胞盡快貼壁，是決定培養(yǎng)成功的關(guān)鍵步驟： 1、取決于適當(dāng)?shù)纳L基質(zhì)表面； 2、可降低接種后培養(yǎng)液對細(xì)胞的浮力，如先少補(bǔ)加少量培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁后再補(bǔ)足營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)； 3、注意適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種密度，一般105個/ml左右。 傳代培養(yǎng):當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時間的延長和細(xì)胞不斷分裂，一則細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面也會因營養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長或發(fā)生中毒。此時就需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)。這個過程就稱為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）。對單層培養(yǎng)而言，80%匯合或剛匯合的細(xì)胞是較理想的傳代階段。 體外培養(yǎng)技術(shù)中所謂的傳“代”概念并不等于細(xì)胞生物學(xué)中“親代細(xì)胞”與“子代細(xì)胞”中“代”的概念。傳代培養(yǎng)的實質(zhì)就是分割后再一次培養(yǎng)，可以相對地衡量培養(yǎng)物的培養(yǎng)年齡。 5 培養(yǎng)實驗 實驗原理 傳代培養(yǎng)是組織培養(yǎng)常規(guī)保種方法之一。也是幾乎所有細(xì)胞生物學(xué)實驗的基礎(chǔ)。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長滿后就需要將其稀釋分種成多瓶，細(xì)胞才能繼續(xù)生長。這一過程就叫傳代。傳代培養(yǎng)可獲得大量細(xì)胞供實驗所需。傳代要在嚴(yán)格的無菌條件下進(jìn)行，每一步都需要認(rèn)真仔細(xì)的無菌操作。 實驗材料和器材 材料：培養(yǎng)瓶，試管，移液管，巴斯德吸管，廢液缸，75％酒精棉球，酒精燈，培養(yǎng)細(xì)胞。 藥品：培養(yǎng)基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清或胎牛血清，0.25％胰蛋白酶，Hanks液。 儀器：C02培養(yǎng)箱，倒置：顯微鏡，超凈臺。 實驗步驟 1．人無菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒雙手。 2．倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否需要傳代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù)。將培養(yǎng)用液置37℃下預(yù)熱。 3．超凈臺臺面應(yīng)整潔，用0.1％新潔爾滅溶液擦凈。 4．打開超凈臺的紫外燈照射臺面20min左右，關(guān)閉超凈臺的紫外燈，打開抽風(fēng)機(jī)清潔空氣，除去臭氧。 5．點燃酒精燈；取出無菌試管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮頭；過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管內(nèi)。 6．將培養(yǎng)用液瓶口用75％酒精消毒，過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。 7．倒掉培養(yǎng)細(xì)胞的舊培養(yǎng)基。酌情可用2—3mLHanks液洗去殘留的舊培養(yǎng)基，或用少量胰酶涮洗一下。 8．每個大培養(yǎng)瓶加入1mL胰酶，小瓶用量酌減，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞收回突起變圓時立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫離胰酶，然后將胰酶倒掉。注意勿使細(xì)胞提早脫落入消化液中。 9．加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基，反復(fù)吹打消化好的細(xì)胞使其脫壁并分散，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補(bǔ)加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基(7～10mL／大瓶，3～5mL／小瓶)制成細(xì)胞懸液，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋上瓶蓋，適度擰緊后再稍回轉(zhuǎn)，以利于CO2氣體的進(jìn)入，將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。 10．對懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，步驟7-9不做?？蓪⒓?xì)胞懸液進(jìn)行離心去除舊培養(yǎng)基上清，加入新鮮培養(yǎng)基，然后分裝到各瓶中。 注意事項 1．傳代培養(yǎng)時要注意無菌操作并防止細(xì)胞之間的交叉污染。所有操作要盡量靠近酒精燈火焰。每次最好只進(jìn)行一種細(xì)胞的操作。每一種細(xì)胞使用一套器材。培養(yǎng)用液應(yīng)嚴(yán)格分開。 2．每天觀察細(xì)胞形態(tài)，掌握好細(xì)胞是否健康的標(biāo)準(zhǔn)：健康細(xì)胞的形態(tài)飽滿，折光性好，生長致密時即可傳代。 3．如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有污染跡象，應(yīng)立即采取措施，一般應(yīng)棄置污染的細(xì)胞，如果必須挽救，可加含有抗生素的BSS或培養(yǎng)基反復(fù)清洗，隨后培養(yǎng)基中加入較大量的抗菌素，并經(jīng)常更換培養(yǎng)基等 6 培養(yǎng)細(xì)胞
在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，盡管人們已經(jīng)能夠重新構(gòu)建牙冠結(jié)構(gòu)，然而重新構(gòu)建結(jié)構(gòu)復(fù)雜的牙根始終是不少科研人員的終極夢想。第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院文玲英教授等在一項國家自然科學(xué)基金資助課題中，培養(yǎng)出了純化的牙囊細(xì)胞，盡管這離重新構(gòu)建牙根還有很長的距離，但畢竟又向前邁了一步。 牙囊是牙胚的重要組成部分，隨著牙齒的發(fā)育，由它分化的細(xì)胞形成牙骨質(zhì)、牙周膜和部分牙槽骨，換句話說，由牙囊發(fā)育的組織結(jié)構(gòu)主要負(fù)責(zé)將牙齒固定在牙槽骨上。另外在牙齒萌出的過程中，牙囊細(xì)胞還可能通過對一些細(xì)胞和因子進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)牙齒的順利萌出。 牙囊細(xì)胞的重要功能吸引了研究者的目光，但要進(jìn)行深入的研究就需要首先分離出純化的牙囊細(xì)胞。早在上世紀(jì)90年代，國外就已經(jīng)開展了分離牙囊的研究，但由于牙囊與成釉器（上皮來源）“關(guān)系密切”，始終難以簡便地獲得純化的牙囊細(xì)胞。 據(jù)研究人員劉曉輝介紹，牙囊細(xì)胞和成釉器分別來源于外胚間充質(zhì)和口腔上皮，這兩類細(xì)胞在培養(yǎng)時對培養(yǎng)皿具有不同的黏附能力，當(dāng)使用胰酶消化時，黏附能力較差的牙囊細(xì)胞會首先掉下來，成釉器上皮細(xì)胞則要慢一些，這就是差速消化的概念。利用差速消化法，收集牙囊細(xì)胞并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，就稱為差速傳代技術(shù)。經(jīng)3～4次差速傳代，最終就可以得到純化的牙囊細(xì)胞了。 在研究過程中，他們選用大鼠第一和第二磨牙牙胚，剝離出牙囊和成釉器作混合培養(yǎng)，經(jīng)3次差速傳代后，成功地從第4代牙胚原代細(xì)胞中獲得了純化的牙囊細(xì)胞。經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)及免疫化學(xué)染色檢測結(jié)果顯示純化率達(dá)100％，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，增殖旺盛。 文教授說，差速傳代培養(yǎng)技術(shù)是一種很有效且操作簡單、廉價的研究方法，培養(yǎng)的高純化牙囊細(xì)胞為今后牙齒組織工程提供了種子細(xì)胞，下一步他們準(zhǔn)備將純化牙囊細(xì)胞應(yīng)用于牙根的重新構(gòu)建研究中。
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