一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/b>
通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)PCR反應(yīng)的基本原理，掌握PCR的基本操作技術(shù)以及瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。
二、 實(shí)驗(yàn)原理
PCR用于擴(kuò)增位于兩端已知序列之間的DNA區(qū)段，即通過(guò)引物延伸而進(jìn)行的重復(fù)雙向DNA合成。基本原理及過(guò)程如下：
PCR循環(huán)過(guò)程中有三種不同的事件發(fā)生：（1）模板變性；（2）引物退火；（3）熱穩(wěn)定DNA聚合酶進(jìn)行DNA合成。
1.變性：加熱使模板DNA在高溫下（94-95℃）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。
2.退火：在體系溫度降至37-65℃，模板DNA與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合，使引物與模板鏈3’端結(jié)合，形成部分雙鏈DNA，即退火階段。
3.延伸：體系反應(yīng)溫度升至中溫72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA，即引物的延伸階段。
上述3步為一個(gè)循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個(gè)階段。從理論上講，每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過(guò)25～30個(gè)循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106～109倍。
典型的PCR反應(yīng)體系由如下組分組成：DNA模板、反應(yīng)緩沖液、dNTP、MgCl2、兩條合成的DNA引物、耐熱DNA Taq聚合酶。
三、實(shí)驗(yàn)材料及相關(guān)試劑
基因組DNA，基因特異性引物，PCR擴(kuò)增相關(guān)試劑，等
四、實(shí)驗(yàn)步驟
1．模板DNA的抽提：實(shí)驗(yàn)一所得的水稻基因組DNA。
2．PCR操作 (在冰上操作)：
（1）PCR反應(yīng)混合液的配制：反應(yīng)體系25 µL, 在無(wú)菌的0.2 mL離心管中按下列操作程序加樣：
| 反應(yīng)物 | 加樣順序 | 體積/µL | 終濃度 |
| ddH2O | 1 | 17.3×n | |
| 10 x Buffer | 2 | 2.5×n | 1 x |
| 25 mmol/L MgCl2 | 3 | 1.5×n | 1.5 mmol/L |
| 10 mmol/L dNTP | 4 | 0.5×n | 200 µmol/L |
| 10 µM上游引物 | 5 | 1×n | 0.4 µmol/L |
| 10 µM下游引物 | 6 | 1×n | 0.4 µmol/L |
| DNA Taq聚合酶 | 7 | 0.2×n | 1 U |
（2）將反應(yīng)混合液混勻, 然后每個(gè)PCR管中分裝24 µL反應(yīng)混合液，再加1 µL模板DNA，最后加1滴石蠟油，防止水分蒸發(fā), 然后稍離心。
