在ELISA實驗前的注意事項
- 仔細閱讀說明書
- 確定試劑盒在有效期內(nèi)
- 按說明書確定所有試劑齊全（數(shù)量、體積）
- 標本制備要規(guī)范，每份標本體積要按2-3個復(fù)孔以上的量制備（貯存），盡量分裝做備份。短期內(nèi)無法實驗者，注意低溫保存
- 準備好所有實驗額外所需物品，如試管、吸頭、移液器、離心機等
- 根據(jù)檢測標本數(shù)量確定所需試劑的量
- 按說明書將所用試劑平衡至室溫，配制所需試劑
DIY夾心法ELISA常見技術(shù)指南
- 選擇抗體時最好選擇一個單抗和一個多抗進行配對；若選擇兩個單抗，必須識別不同表位的抗體；最好從同一家公司選擇抗體對。
- ELISA實驗中為了確定最佳信號和最低背景應(yīng)將捕獲抗體（0.5-4μg/ml）和檢測抗體（0.25-2μg/ml）在預(yù)實驗中進行彼此相抗的滴定。同時，應(yīng)包括在適當范圍內(nèi)的標準品的系列稀釋。按試劑說明書常規(guī)提供的范圍進行操作。
- 標準品的配制：對于每種細胞因子應(yīng)仔細閱讀說明書，注意每批的細節(jié)。在使用細胞因子前，瞬時離心試劑瓶，盡可能多地收回其中的細胞因子。根據(jù)每批說明書中的細節(jié)，將凍干的細胞因子復(fù)溶。
- 一般待測抗原標準曲線的線性范圍的可通過將標準品做8次2倍系列稀釋從2000pg/ml 到15pg/ml。可利用標準的ELISA操作流程、放大試劑盒、第三類試劑、或改變酶底物系統(tǒng)可在一定范圍內(nèi)提高靈敏度。
- 為了優(yōu)化靈敏度，建議過夜孵育標準品和標本。
- 若使用過氧化物酶作為顯色系統(tǒng)，應(yīng)嚴禁在洗液和稀釋液中加疊氮鈉，疊氮鈉可抑制過氧化物酶的活性。
- 當測定混合液體中的抗原時，如血清，建議在標本稀釋液中加不相干的Ig.
ELISA常見問題及處理對策
|
問題
|
可能原因
|
解決方法
|
|
無顏色
|
試劑孵育的時間沒有按說明書操作。 | 確定生物素化抗體，連接的HRP試劑或鏈霉親和素-HRP使用的時間是否適當。 |
| 不同試劑盒或不同批號的試劑混用。 | 重新檢查試劑的標簽，確準所有組分都屬于正使用的試劑盒中的。不能混用不同試劑盒或不同批號的試劑。 | |
| 漏加酶 | 檢查操作流程，注意不要漏加 | |
| HRP酶污染了疊氮鈉 | 使用新配制的試劑，禁含疊氮鈉 | |
| 標準品有問題（若在標本孔中有信號） | 按說明書檢查標準品的制備使用1瓶新標準品 | |
| 某一容器未洗凈,殘留滅活酶物質(zhì) | 盡可能用試劑盒內(nèi)容器,另覓一定要潔凈、可靠 | |
| 使用含血清的緩沖液配制/復(fù)溶抗體 | 重新確認所選用的試劑 | |
| .漏加顯色劑A或B | 加顯色劑后觀察一下液面高度 | |
| 試劑配制/使用有誤 | 將實驗重做；嚴格按說明書操作，每次配制和使用前看清標簽。 | |
| 緩沖液污染 | 配制新新鮮的緩沖液 | |
|
顯色弱
|
超過有效期的產(chǎn)品可能會產(chǎn)生很弱的信號。 | 檢查產(chǎn)品的有效期 |
| 加入試劑的體積和時間有誤 | 確定所使用的每一個試劑的體積正確的和加入的時間是適當?shù)摹?/td> | |
| 試劑、樣品用前未能平衡 | 用前試劑、樣品置室溫平衡10分鐘左右 | |
| 縮短孵育時間能使實驗的信號變?nèi)酢?/td> | 檢查孵育的時間。 | |
| 在溫度變化的環(huán)境內(nèi)孵育酶標板。 | 確定孵育的溫度，應(yīng)避免溫度的變化。 | |
| 使用了被污染的試劑 | 檢查試劑是否被污染。 | |
| 標準品/標本制備方法不規(guī)范 | 檢查標準品/標本的制備，標準品應(yīng)按說明書進行復(fù)溶和稀釋。低溫貯存的標本避免反復(fù)凍融，嚴禁使用溶血標本。樣品用 NaN3防腐,抑制了酶的反應(yīng) | |
| 顯色底物制備不規(guī)范 | 檢查底物的制備，如體積是否正確，混合是否恰當充分。 | |
| 檢測時間不當 | 是否在規(guī)定的時間內(nèi)檢測。 | |
| 儀器設(shè)定不正確，濾光片不匹配。 | 儀器是否設(shè)定正確，濾光片的使用等。 | |
|
高背景（本底）
|
洗滌操作不規(guī)范 | 洗板不充分，使用手工洗板常出現(xiàn)。最好使用洗板機，或使用洗瓶洗滌。每孔應(yīng)完全充滿洗滌緩沖液，傾出時應(yīng)迅速。若使用洗板機，應(yīng)校準并設(shè)定足夠充滿每孔的體積量。板的內(nèi)側(cè)不應(yīng)接觸設(shè)備。檢查每孔是否有殘留的洗液或每孔加樣量的體積是否準確。在兩次洗板之間加30秒的浸泡。 |
| 實驗中孵育溫度和時間不適當 | 確定每一實驗步驟的孵育溫度和時間是否適當 | |
| 酶加量過多 | 加酶前驗看移液器調(diào)節(jié)量是否準確。檢查稀釋度，若必要進行效價測定。 | |
| 封閉不完全 | 檢查封閉液的計算量；提高封閉時間。 | |
| 標本或標準品中的干擾物質(zhì) | 做適當?shù)膶φ?/td> | |
| 顯色劑受光照時間較長,或污染 | 顯色劑A和B應(yīng)于使用前10分鐘從冰箱取出 | |
| 整批樣品放置時間過長,樣品污染 | 樣品應(yīng)保持新鮮,或低溫保存,防止污染 | |
| 緩沖液污染 | 制備新鮮的緩沖液 | |
| 吸頭重復(fù)使用,未洗凈或消毒不完全而用于加酶或顯色劑 | 吸頭盡可能一次性使用 | |
| 太多的信號：全部的板子變成規(guī)則的藍色 | 不充分的洗滌/洗滌步驟被遺漏-沒結(jié)合的過氧化物酶仍有殘留。 | 最好使用洗板機充分洗滌檢查孔內(nèi)是否有殘留的洗液或加樣量是否準確。 |
| 底物溶液混合太早并轉(zhuǎn)成藍色 | 應(yīng)控制底物混合的時機并立即使用 | |
| 太多的酶結(jié)合物 | 檢查稀釋度，必要時進行效價測定 | |
| 封板膜或試劑容器被重復(fù)使用，導(dǎo)致HRP殘留，使TMB底物產(chǎn)生非特異藍色。 | 使用新鮮的封板膜，每步使用不同的試劑容器 | |
| 緩沖液中污染金屬或HRP | 制備新鮮緩沖液 | |
|
高CV值（CV：coefficient of variation），花板
|
操作不慎或洗滌不充分 | 按說明書洗板、加樣、顯色。洗板尤為重要，如上所述 |
| 出現(xiàn)干板，沒有使用封板膜、封板膜重復(fù)使用 | 確定每兩步驟間，酶標板應(yīng)保持濕潤。使用封板膜封口，注意每步使用新鮮的封板膜。 | |
| 由于操作失誤或板子質(zhì)量差（結(jié)合不均勻）造成包板不均勻。 | 稀釋用的PBS中不要加其它蛋白檢查包被和封閉液體積、時間和試劑加入的方法。
檢查所使用的酶標板，使用ELISA板子（不要使用組織培養(yǎng)板）
|
|
| 移液器不準確，吸頭重復(fù)使用。 | 檢查并校準移液器。每次取樣必須換吸頭?；仡櫂吮镜募尤氩襟E，確保每次加樣的準確性，保證吸取的液體按所設(shè)定的體積吸入和排出，連續(xù)加樣時注意檢查吸頭，確保所加液體的體積。 | |
| 樣品離心處理不全,反應(yīng)孔內(nèi)發(fā)生凝血或殘留細胞成分 | 標本充分離心, 3000rpm 6分以上，嚴禁使用凝血（溶血）的標本 | |
| 緩沖液污染 | 制備新鮮的緩沖液 | |
|
標準曲線可得到，但兩點之間區(qū)別很差（低或平的曲線）
|
酶結(jié)合物不足 | 檢查稀釋度，必要時進行效價測定 |
| 捕獲抗體沒有很好結(jié)合到板上 | 檢查所使用的酶標板，使用ELISA板子（不要使用組織培養(yǎng)板）稀釋用的PBS中不要加其它蛋白 | |
| 檢測抗體不足 | 檢查稀釋度，必要時進行效價測定 | |
| 板子顯色不足 | 延長底物孵育實驗使用推薦品牌的底物溶液 | |
| 操作不慎 | 回顧ELISA操作流程，消除任何擅自修改的程序。 | |
| 標準曲線稀釋度計算有誤 | 核查計算的情況，制備新的標準曲線 | |
| 標準曲線很好，但是沒有任何期望的陽性信號產(chǎn)生 | 在標本中無相應(yīng)的細胞因子 | 使用內(nèi)參對照重復(fù)實驗，重新考慮實驗的相應(yīng)參數(shù) |
| 標本基質(zhì)遮蓋檢測 | 將標本至少做1∶2相應(yīng)的稀釋，或進行系列稀釋觀測它的恢復(fù)性 | |
| 標準曲線很好，但是標本的判讀值很高 | 標本中含的細胞因子水平超過實驗范圍 | 將標本做稀釋并再次實驗 |
| 當使用HRP酶結(jié)合物時，TMB底物加終止液后顯綠色 | 孔中的試劑顯色不充分 | 輕輕振蕩板子 |
|
邊緣效應(yīng)
|
工作環(huán)境溫度不均衡 | 避免將板子在變化溫度環(huán)境中孵育 |
|
漂移
|
實驗過程中出現(xiàn)間斷 | 整個實驗應(yīng)連續(xù)操作：在實驗開始前將所有標準品和標本做適當?shù)臏蕚?/td> |
| 試劑沒有按說明書平衡至室溫 | 在所有試劑加入孔前，確保它們已平衡至室溫，除非說明書中有另外的要求。 | |
| 是否可更改試劑盒 所提供的實驗操作步驟？ | 一般廠商為確保最高的靈敏度和特異性，對試劑盒都進行了優(yōu)化，為確保每一試劑盒實驗的規(guī)范性應(yīng)按說明書操作。 | |
| 是否可混用不同試劑盒中的試劑？ | 不行。絕大多數(shù)試劑在每批試劑盒中是特異的，若有問題可與廠家或代理商聯(lián)系。 | |
| 是否可增加或減少標本的體積。 | 商品化的試劑盒所需加入的標本體積是優(yōu)化的，應(yīng)按說明書操作，不建議更改所加標本的體積。 | |
| 是否可重確定自己的標準曲線的點？ | 可以。說明書上有建議的制備標準曲線時標準品的稀釋度，可改變稀釋倍數(shù)和增加曲線的點，但是必須在實驗范圍內(nèi)，高于試劑盒中最高標準品的點和低于靈敏度以下的點是無效的。 |