試驗原理：
堿裂解法是較常用的提取的方法。其優(yōu)點是收獲率高，適于多數(shù)的菌株，所得產(chǎn)物經(jīng)純化后可滿足多數(shù)的DNA重組操作。十二烷基磺進(jìn)行質(zhì)粒的小量制備。十二烷基磺酸鈉（SDS）是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性。用SDS處理細(xì)菌后，會導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞破裂，釋放出質(zhì)粒DNA和染色體DNA，兩種DNA在強堿環(huán)境都會變性。由于質(zhì)粒和主染色體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不同，變性時前者雖然兩條鏈分離，卻仍然纏繞在一起不分開；但后者完全變性分甚至出現(xiàn)斷裂，因此，當(dāng)加入pH4.8的酸性乙酸鉀降低溶液pH值，使溶液pH值恢復(fù)較低的近中性水平時， 質(zhì)粒的兩條小分子單鏈可迅速復(fù)性恢復(fù)雙鏈結(jié)構(gòu)，但是主染色體DNA則難以復(fù)性。在離心時，大部分主染色體與細(xì)胞碎片，雜質(zhì)等纏繞一起被沉淀，而可溶性的質(zhì)粒DNA留在上清夜中。再由異丙醇沉淀、乙醇洗滌，可得到純化的質(zhì)粒DNA。堿裂解法提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴增、銀染序列分析等。
試驗準(zhǔn)備：
1、 溶液Ｉ:pH8.0 GET緩沖液（50mmol葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L Tris－HCl）；溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高壓下蒸氣滅菌15min，貯存于４℃。葡萄糖的作用是使懸浮后的大腸桿菌不會很快沉積到管子的底部，增加溶液的粘度，維持滲透壓及防止DNA受機械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2＋ 和Mg2 ＋等二價金屬離子的螯合劑，在溶液I中加入EDTA，是要把大腸桿菌細(xì)胞中的二價金屬離子都螯合掉。從而起到抑制DNase
對DNA的降解和抑制微生物生長的作用。
2、 溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(內(nèi)含1％的SDS)，這個用的時候需現(xiàn)配。要新配置溶液Ⅱ是為了避免NaOH接觸空氣中的CO2而減弱了堿性。NaOH是最佳溶解細(xì)胞的試劑。不管是大腸桿菌還是哺乳動物細(xì)胞，碰到了堿都會在瞬間溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化。用不新鮮的0.4 N NaOH，即便有SDS也無法有效溶解大腸桿菌。SDS是離子型表面活性劑。它主要作用是：a溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，從而破壞細(xì)胞膜。b解聚細(xì)胞中的核蛋白。c能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-…R＋-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。 SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下來的提取過程必須把它去除干凈，以便下一步試驗的更好進(jìn)行。
3、 溶液Ⅲ：pH4.8乙酸鉀溶液（60ml 5mol/L KAc，11.5ml冰醋酸，28.5mlH2O）；該溶液鉀離子濃度為3mol/L，醋酸根離子濃度為5mol/L. pH4.8的乙酸鉀溶液是為了把抽提液的pH調(diào)至中性，從而使變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性，且穩(wěn)定存在。溶液III加入后的沉淀實際上是K+置換了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚，使得沉淀更完全。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，后者是因為鹽與SDS－蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鹽形式復(fù)合物。
4、 異丙醇；采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同，PEG的濃度低，選擇性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的濃度只需1％左右，小分子所需PEG濃度高達(dá)20％。
5、 無水乙醇：乙醇可以以任意比和水相混溶，而DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，同時乙醇與核酸不起化學(xué)反應(yīng)，因此是理想的沉淀劑。加入的乙醇后，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，DNA失水聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67％左右。也可改用95％乙醇來替代無水乙醇。但是加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95％乙醇代替無水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15－30min即可。但因為使用異丙醇時常把鹽沉淀下來，所以較多的還是使用乙醇。
6、 pH8.0TE緩沖液；10mmol/LTris－HCl，1mmol/L EDTA，其中含 RNA酶 20ug/ml。在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa＝7.2）和硼酸系統(tǒng)（pKa=9.24)等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實驗時，磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2+產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反應(yīng)時，不同的酶對輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。酚與水有一定的互溶，苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過程中，不致吸收樣品中含有DNA的水分，減少DNA的損失。用Tris調(diào)節(jié)至pH為8是因為DNA在此條件下比較穩(wěn)定。在中性或堿性條件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游離到水相，所以可獲得RNA含量較少的DNA樣品。
7、 70％乙醇試驗步驟:
1、 無菌操作臺上,取1.5ml培養(yǎng)菌體置于離心管（Eppendorf管）中，微量離心機上以10000rpm離心1min，或者以4000 rpm離心5－10min，棄上清液，離心管倒扣于干凈的吸水紙上吸干。
2、 沉淀中加100μl用冰預(yù)冷的溶液I，加或不加入少量溶菌酶粉末，充分混合（需要劇烈振蕩）。室溫下放置10min。
3、 加入200μl溶液 II(新鮮配置)，加蓋后輕輕快速顛倒離心管數(shù)次混勻（千萬不要振蕩），冰浴5 min 。
4、 加入150μl預(yù)冷溶液III，輕輕顛倒數(shù)次混勻（10s），置于冰浴15 min 。
5、 微量離心機上以4℃，12000rpm離心15min，取上清液于另一新Eppendorf管中。
6、 上清夜中加入等體積酚/氯仿（1：1）混勻，微量離心機上以4℃，12000rpm,離心5min。{經(jīng)驗之談：如果選用宿主合適的話（如DH5a、XL1-red等，HB101和BL21則不行），可以不用酚氯仿抽提這一步。用1倍體積的乙醇沉淀，沉淀中所含的鹽和RNA就很少了，完全去除上清液后就可以直接加TE溶解質(zhì)粒，后續(xù)的限制性酶切、轉(zhuǎn)化完全沒有問題。僅供參考}
7、 小心轉(zhuǎn)上層至一新的離心管棄去中層的蛋白質(zhì)和下層的有機相。
8、 小心移出上清于一新Eppendorf管中,加入2 /3倍體積異丙醇,混勻, 4℃離心12000g×5min。
9、 上清夜中加入2倍體積的無水乙醇混勻，室溫下放置5min－10min，以12000rpm,離心5min-15min。
10、 1.0ml預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀1 ～2次,沉淀在室溫下晾干。
11、 小心吸去上清夜，將離心管倒置于一張紙上，使所有的液體流出。再將附著在管壁上的液滴除去。在除去管壁上的液滴時，可以用一次性吸頭與真空管相連，用吸頭接觸液面。但在液體吸出時應(yīng)當(dāng)盡量使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀。自然干燥或者真空抽干到看不到液滴最好。
12、 加入50μlTE緩沖液（PH 8.0 含20μg/mlRNaseA）溶解質(zhì)粒粗提物，在-20℃保存。
注意事項：
提取過程應(yīng)盡量在低溫環(huán)境中進(jìn)行，蛋白質(zhì)的去除以酚/氯仿混合效果最好，可以采取多次抽提盡量將蛋白質(zhì)除干凈，在沉淀DNA 時通常使用冰乙醇，在低溫條件下放置可使DNA沉淀完全。同時反應(yīng)中加入的鹽濃度一定要控制好，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鉀鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鉀溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。一般情況下都是加入的最終濃度達(dá)0.1～0.25mol/L為宜。 |
