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          生物知識

          影響ELISA效果的常見問題及對策

          作者:admin 來源:本站整理 發(fā)布時間: 2011-01-13 09:38  瀏覽次數(shù):
          購買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 m.kjhfd.cn

          ELISA是酶聯(lián)免疫吸附測定的簡稱,是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。它以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ),將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合,由于抗原、抗體反應(yīng)在一種固相載體—
          ELISA是酶聯(lián)免疫吸附測定的簡稱,是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。它以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ),將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合,由于抗原、抗體反應(yīng)在一種固相載體——聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行,每加入一種試劑孵育后,可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物,從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。ELISA以操作簡便、靈敏度較高、特異性較好等特點而在臨床上獲得廣泛應(yīng)用,尤其是各型病毒性肝炎感染標(biāo)志物的檢測。但其操作步驟較多,各個環(huán)節(jié)都可能對其檢測效果產(chǎn)生影響.所以有必要對于臨床操作中可能出現(xiàn)的問題及其解決辦法加以探討。

          一、試劑的選擇

          優(yōu)良的檢測試劑對于結(jié)果準(zhǔn)確的必要性不容置疑。注意操作嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行,試驗前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘。

          二、加樣

          (一)可能出現(xiàn)的問題

          1.血清或血漿標(biāo)本分離不好即進(jìn)行加樣或者待檢標(biāo)本污染或溶血,紅細(xì)胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì),以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中,溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色。如有細(xì)菌污染,菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。

          2.手工操作中,加樣板過多造成加樣后放人孵箱前等待時間長(特別是室內(nèi)溫度較高時),或者加樣不準(zhǔn)確,各孔標(biāo)本或試劑含量有差別。

          3.加完標(biāo)本再加酶試劑時酶濺出。

          (二)解決方法

          1.可用作ELISA測定的標(biāo)本十分廣泛,體液(如血清)、分泌物(如唾液)和排泄物(如尿液、糞便)等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測定(如血清、尿液),有些則需經(jīng)預(yù)處理(如糞便和某些分泌物)。大部分ELISA檢測均以血清為標(biāo)本。標(biāo)本為血清:最好將血液先于室溫放置1-2小時后,再用3000r/min離心lO分鐘;標(biāo)本若為血漿,必須使用含抗凝劑的血液標(biāo)本收集管,采血后立即顛倒采血管混合5-10次,放置一段時間后,3000r/min離心15分鐘。血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測,如在冰箱中保存過久,其中的蛋白質(zhì)可發(fā)生聚合,在間接ELISA中可使本底加深。一般說來,在5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4~C,超過一周測定的需低溫冰存。凍結(jié)血清融解后,蛋白質(zhì)局部濃縮,分布不均,應(yīng)充分混勻,宜輕緩,避免氣泡,可上下顛倒混和。

          2.在ELISA中一般有3次加樣步聚,即加標(biāo)本,加酶結(jié)合物,加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡。加樣后及時放入孵箱溫育。

          3.從冰箱中取出的試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。加酶試劑后用吸水紙在酶標(biāo)板表面輕拭吸干。

          4.標(biāo)本較多時,請分批操作。

          三、孵育

          在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng),即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后??乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間,這一保溫過程稱為溫育。此過程中可能出現(xiàn)的問題有:孵育時未貼封片或加蓋,使標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā).吸附于孔壁,難于清洗徹底。故應(yīng)注意溫育的溫度和時間,應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確,如果孵育時間人為延長,將導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍難以徹底清洗。為保證這一點,一個人操作時,一次不宜多于兩塊板。

          四、洗板

          洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟,但卻也決定著實驗的成敗。ELISA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。采用手工洗板時,孔與孔之間液體交叉。采用半自動洗板機(jī)洗板時,洗液量不足可能導(dǎo)致洗板不徹底;洗板針堵塞,可能導(dǎo)致抽吸不完全;洗板不暢可能導(dǎo)致洗板效果差;反應(yīng)板過多可能導(dǎo)致洗板等待時間長。以上情況均可造成結(jié)果誤差,解決的方法是保證洗液注滿各孔,洗板釘暢通,洗完板后最好在吸水紙(選擇干凈、無塵的吸水材料)上輕輕拍干;合理安排洗板時間,交替操作。

          五、顯色

          顯色是ELISA中的最后一步溫育反應(yīng),反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi),陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。顯色劑盡量在臨用前配制,不用過期顯色劑肉眼可見淺藍(lán)色的TMB顯色劑堅決不用;當(dāng)室溫較低時應(yīng)適當(dāng)延長顯色時間;加樣時保持顯色劑不外流以免造成液體回流;A、B液應(yīng)避免接觸金屬器械。

          六、終止

          加終止液時產(chǎn)生較多氣泡,會導(dǎo)致假陽性增加,在操作中加以注意就能避免。

          七、讀板

          讀板時板底如不清潔也可能造成讀數(shù)不準(zhǔn)。酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強光照射下,操作時室溫宜在15-30℃,使用前先預(yù)熱儀器l5~3O分鐘,測讀結(jié)果更穩(wěn)定。
          此外,整個操作過程中應(yīng)保證酶標(biāo)板不接觸次氯酸等腐蝕性物品。如有條件實現(xiàn)ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)自動化,可以有效提高檢測質(zhì)量。在實際操作中,除了選擇優(yōu)良試劑外,必須嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行操作,同時做好室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評,以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ髯黠L(fēng)檢測每一份標(biāo)本,才能保證檢測質(zhì)量?,F(xiàn)在國內(nèi)已有相當(dāng)數(shù)量的單位擁有全自動酶標(biāo)儀,這對于實現(xiàn)ELISA標(biāo)準(zhǔn)化檢測、提高檢測質(zhì)量起到了重要作用。


           

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