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           生物知識(shí) 
      
          
        
           
          
          細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基的方法
          
          
          作者：admin 來源：本站 
            發(fā)布時(shí)間： 2011-01-07 16:51　
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                購買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 
                  m.kjhfd.cn
              
          
            
          
          
          
        
          
        
           
          
           
            
          
              
           
                
          1. 直接適應(yīng)——細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基（SFM）中。
          

          
　　一些類型細(xì)胞可直接從包含血清的          培養(yǎng)基適應(yīng)無血清培養(yǎng)基。對(duì)于直接適應(yīng)，接種細(xì)胞密度應(yīng)該:2.5×105~3.5×105細(xì)胞/ml。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106~3×106細(xì)胞/ml時(shí)，傳代培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度在培養(yǎng)4到7天后達(dá)到2×106~4×106細(xì)胞/ml時(shí)，細(xì)胞完全適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基。每隔3~5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106~3×106細(xì)胞/ml，細(xì)胞活率在90％時(shí)，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。
          

          
2. 連續(xù)適應(yīng)——分好幾步把細(xì)胞從添加血清的          培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基（SFM）中，與直接適應(yīng)相比較，連續(xù)適應(yīng)趨向?qū)τ诩?xì)胞更加溫和一些。
          

          
（1） 以2倍正常接種密度接種生長(zhǎng)活躍的細(xì)胞培養(yǎng)物到75％有血清          培養(yǎng)基：25％SFM 混合培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)。
          

          
（2） 當(dāng)細(xì)胞密度>5×105細(xì)胞/ml時(shí)，以2×105到3×105細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，在有血清          培養(yǎng)基：SFM為50∶50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。
          

          
（3） 以2×106到3×106細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，25％有血清          培養(yǎng)基和75％ SFM中傳代培養(yǎng)。
          

          
（4） 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106到3×106細(xì)胞/ml（接種后4到6天），在100％SFM          培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。
          

          
（5） 每隔3到5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106到3×106細(xì)胞/ml，細(xì)胞活率在90％時(shí)，貯備的適應(yīng)了無血清          培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。
          

          
　　建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物，直到每一次細(xì)胞適應(yīng)了新的混合          培養(yǎng)基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進(jìn)行幾次傳代。
          

          
　　在適應(yīng)過程中，最好不要讓細(xì)胞生長(zhǎng)過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清          培養(yǎng)基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì)，因而更易于受外界因素的影響。
          

          
　　細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)替代血清：許多細(xì)胞利用連續(xù)適應(yīng)方法能很好的適應(yīng)，用包含F(xiàn)BS的的          培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基1∶1（v∶v）的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。通過下列的混合培養(yǎng)基的方式，連續(xù)幾代減少當(dāng)前培養(yǎng)基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培養(yǎng)基。每次適應(yīng)改變血清比例時(shí)，傳代細(xì)胞2到3 次。
          

          
　　培養(yǎng)可以直接從FBS轉(zhuǎn)換到替代血清。一開始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長(zhǎng)的延遲可能會(huì)發(fā)生，4允許進(jìn)行2到3次的傳代，使生長(zhǎng)率恢復(fù)到以前的水平。
          

          

          

          
　　特別需要強(qiáng)調(diào)的是：配制無血清培養(yǎng)液必須使用高質(zhì)量的水，如石英玻璃蒸餾器經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因?yàn)闊o血清          培養(yǎng)基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護(hù)細(xì)胞的大分子，既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微，也可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生致死性損害。這是無血清培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。
          

          
無血清          培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)
          

          
1. 可避免血清批次間的質(zhì)量變動(dòng)，提高細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。
          

          
2. 避免血清對(duì)細(xì)胞的毒性作用和血清源性污染。
          

          
3. 避免血清組分對(duì)實(shí)驗(yàn)研究的影響。
          

          
4. 有利于體外培養(yǎng)細(xì)胞的分化。
          

          
5. 可提高產(chǎn)品的表達(dá)水平并使細(xì)胞產(chǎn)品易于純化。
          

          

          
缺點(diǎn)：
          

          
1. 細(xì)胞在無血清          培養(yǎng)基中易受某些機(jī)械因素和化學(xué)因素的影響，培養(yǎng)基的保存和應(yīng)用不如傳統(tǒng)的合成培養(yǎng)基方便。
          

          
2. 成本較高。
          

          
3. 針對(duì)性很強(qiáng)，一種無血清          培養(yǎng)基僅適合某一類細(xì)胞的培養(yǎng)。
          

          
無血清          培養(yǎng)基一些配方
          

          
1. 神經(jīng)細(xì)胞，干細(xì)胞，PC12細(xì)胞
          

          
成份    終濃度
          

          
葡萄糖－－0.6％
          

          
谷氨酰胺－2mM
          

          
NaHCO3－－3mM
          

          
Hepes －－5mM
          

          
胰島素－－2.5μg/ml
          

          
轉(zhuǎn)鐵蛋白 －100ng/ml
          

          
孕 酮 －－20nM
          

          
丁二胺－－60μM
          

          
硒酸鈉－－30nM
          

          
青霉素－－50mg/ml
          

          
鏈霉素－－50mg/ml
          

          
最后用DF12添加到100ml即可
          

          
2. 各類小鼠胚胎癌細(xì)胞系          培養(yǎng)基
          

          
DMEM/F12 1:1混合成1000ml
          

          
NaHCO3 2.4g
          

          
HEPES「1.5M」 10.0ul
          

          
硒酸（5*10-6M」 10.0ug
          

          
纖粘連蛋白 1ug/cm2「37度作用15－30分鐘）
          

          
胰島素 1000.0ug
          

          
轉(zhuǎn)鐵蛋白 5000.0ug
          

          
3. NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞          培養(yǎng)基
          

          
DMEM/F12 1:1混合成1000ml
          

          
HEPES 15mM
          

          
大豆胰酶抑制劑 0.1％
          

          
胰島素 10.0ug/ml
          

          
轉(zhuǎn)鐵蛋白 25.0ug/ml
          

          
纖粘連蛋白 5.0ug/ml
          

          
4. 雜交瘤細(xì)胞          培養(yǎng)基
          

          
DMEM/F12 1:1混合成1000ml
          

          
NaHCO3 1.2g/L
          

          
HEPES 15mM
          

          
胰島素 5.0ug/ml
          

          
氨基乙醇 20.0uM
          

          
硒酸 2.5mM
          

          
轉(zhuǎn)鐵蛋白 35.5ug/ml
          
 
          		
              
          
            
          
          
          
        
          
        
           
          
        
           
          
           
            
          
              
           
                
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