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ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡(jiǎn)稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種免疫酶技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)自70年代初問(wèn)世以來(lái)，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。
ELISA基本原理
ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過(guò)洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中，通過(guò)不同的設(shè)計(jì)，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測(cè)抗體的間接法(圖a)、用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法(圖b)以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。
ELISA基本操作步驟
方法一 用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法:
在包被溶液中稀釋純化的包被抗體（一般0.5-4μg/ml），將該稀釋后的包被抗體100μl/孔加入到酶標(biāo)板內(nèi)。
用封板膜將板封好防止蒸發(fā)，在室溫（或4℃）孵育過(guò)夜。
吸干每一板孔并加洗液洗滌，重復(fù)3次。使用洗瓶、多道移液器、多功能分裝器或洗板幾，每孔加400μl徹底洗滌。規(guī)范的操作要求每步完全移出孔中的液體。最后一步，將板中液體移出并將板子在干凈的紙巾上吸附。
加200-300μl/孔封閉液封板，室溫至少孵育1小時(shí)。
重復(fù)步驟3，可利用真空泵干燥板子。加入干燥劑并封板，至少在4-8℃可貯存2個(gè)月。
每孔加100μl適當(dāng)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本，輕輕敲打板子1分鐘。貼上封板膜，室溫孵育2小時(shí)。
重復(fù)步驟3
每孔加100μl經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的生物素化的檢測(cè)抗體，貼上新的封板膜，室溫孵育2小時(shí)
重復(fù)步驟3
每孔加100μl經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的Avidin-HRP或 Streptavidin-HRP，也可加其它種類預(yù)先優(yōu)化物
重復(fù)步驟3
每孔加100μl底物溶液，避光，室溫孵育5-30分鐘進(jìn)行顯色反應(yīng)
每孔加50μl終止液，輕輕振蕩板子確保充分混勻
結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。
方法二 用于檢測(cè)未知抗體的間接法：
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，
每孔加0.1ml，4℃過(guò)夜。次日洗滌3次。
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加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔
中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌。(同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照)
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于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml，
37℃孵育30-60分鐘，洗滌,最后一遍用DDW洗滌。
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其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
ELISA需要的基本試劑：
捕獲抗體
檢測(cè)抗體
鏈霉親和素-HRP
標(biāo)準(zhǔn)品
96孔酶標(biāo)板：選擇具有中等或高吸附力的酶標(biāo)板，禁止使用培養(yǎng)板
包被溶液：0.1M的PBS或者TBS，PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液
阻斷溶液：含3％BSA的TTBS或PBS，或者含有3-5%血清的PBS
標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本稀釋液：含1％BSA的TTBS或PBS
洗液：含0.02％吐溫20的0.002M咪唑鹽溶液或者PH7.4的PBS溶液
底物溶液：兩組份或者一組份的TMB顯色液
終止液：2N的硫酸或者1％HCl溶液
封板膜
ELISA標(biāo)本的制備和貯存
檢測(cè)可溶性蛋白：根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)制備血清、血漿標(biāo)本，由于有些樣品對(duì)溫度敏感極易喪失活性，應(yīng)盡快分離并分裝（一般300～500ul/管），大多數(shù)標(biāo)本收集和實(shí)驗(yàn)在同一天應(yīng)貯存在2～8℃。若無(wú)法立即測(cè)定，應(yīng)貯存在-70℃，標(biāo)本貯存時(shí)間一般不宜過(guò)長(zhǎng)，避免反復(fù)凍融。使用前將標(biāo)本平衡至室溫，融化標(biāo)本嚴(yán)禁使用水浴鍋。凍存后或冷藏時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的標(biāo)本可能會(huì)出現(xiàn)沉淀或小凝集塊，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)前離心或過(guò)濾（0.45um濾膜）標(biāo)本，體積少的標(biāo)本不建議過(guò)濾。所有標(biāo)本的收集要使用無(wú)菌管，在無(wú)菌/半無(wú)菌條件下操作防止污染。
血清：將血液在室溫凝集10～15分鐘，1500g離心20～30分鐘，小心吸取血清。
血漿：按試劑盒中的說(shuō)明書(shū)選擇抗凝劑。收集血液時(shí)，輕輕搖動(dòng)試管使抗凝劑與血液充分混合。將血液在室溫保存10～15分鐘，1500g離心15～20分鐘，小心吸上層血漿。
尿液：將尿液收集在無(wú)菌的容器內(nèi)。1500g離心10～15分鐘或過(guò)濾（0.45um濾膜）去除雜質(zhì)。注意：對(duì)于尿液標(biāo)本實(shí)驗(yàn)的回歸系數(shù)可能發(fā)生變化。
細(xì)胞培養(yǎng)上清液：1500g離心10～15分鐘去除細(xì)胞和細(xì)胞殘?jiān)?。若使用常?guī)典型的培養(yǎng)基，應(yīng)制備兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，一條使用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液/或?qū)嶒?yàn)緩沖液配制標(biāo)準(zhǔn)品，另一條以細(xì)胞培養(yǎng)基配制標(biāo)準(zhǔn)品。若兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線的變化范圍在10%內(nèi)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可用任一曲線分析。
檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)和細(xì)胞內(nèi)蛋白：細(xì)胞相關(guān)蛋白和其它細(xì)胞內(nèi)蛋白在ELISA實(shí)驗(yàn)前需要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行處理將目的蛋白釋放出來(lái)。
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