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          生物知識(shí)

          應(yīng)用PCR-SSCP分析堿基突變的試劑配制與實(shí)驗(yàn)流程

          作者:admin 來源:www.easylabs.com.cn 發(fā)布時(shí)間: 2011-01-05 11:12  瀏覽次數(shù):
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          聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(Single Strand Conformation Polymorphism Analysis of Polymerase Chain Reaction Products, PCR-SSCP)是近年來發(fā)展起來的一種基因分析方法。關(guān)于其原理及應(yīng)用請查看http://www.easylabs.com.cn/show.asp?id=369
           為了高靈敏特異性地顯示SSCP分析結(jié)果,現(xiàn)已發(fā)展多種PCR-SSCP技術(shù),各有其優(yōu)勢及適用領(lǐng)域。例如,可以在PCR擴(kuò)增中用同位素或熒光素等標(biāo)記引物或核苷,也可以在電泳后用銀染或溴化乙錠染色以顯示結(jié)果。這里將重點(diǎn)介紹最常用的放射性同位素PCR-SSCP法。在進(jìn)行PCR擴(kuò)增特定靶基因序列時(shí),利用γ-32P-ATP標(biāo)記引物或直接在PCR反應(yīng)體系中加入α-32P-dCTP進(jìn)行PCR擴(kuò)增,使擴(kuò)增產(chǎn)物帶有同位素標(biāo)記物,然后將擴(kuò)增產(chǎn)物變性為單鏈進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,放射自顯影顯示結(jié)果。利用引物標(biāo)記或堿基摻入法使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物帶有同位素標(biāo)記物,均可使產(chǎn)物信號增強(qiáng)幾個(gè)數(shù)量級。二者相比較,前者經(jīng)濟(jì)、擴(kuò)增特異性強(qiáng),多用于大樣本的檢測和篩選;后者操作簡便,適于一般實(shí)驗(yàn)室開展,可用于小樣本或大樣本的檢測和篩查。本節(jié)僅介紹同位素標(biāo)記堿基摻入法。
          一、試劑準(zhǔn)備
           PCR相關(guān)試劑
           α-32P-dCTP
           3. 5×TBE:每1000 mL中含54 g Tris堿、27.5 g硼酸、20 mL 0.5mol/L EDTApH 8.0)。
           4. 10 mg/ mL溴化乙錠:100 mg溴化乙錠加入10 mL純水中,充分溶解,4℃儲(chǔ)存。
           5. 30% 丙烯酰胺貯液(29:1):將290 g丙烯酰胺和10 g N,N’-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為600 mL的水中。加熱至37℃溶解之,補(bǔ)加水至終體積為1000 mL
           6. 10% 過硫酸胺:10 mL水中加入1 g過硫酸胺,充分溶解,4℃保存。
           
           8. 8% 聚丙烯酰胺膠溶液:量取19 mL 30% 丙烯酰胺貯備液,12 mL 5×TBE,29 mL水,再加入420 μL 10%過硫酸胺和50 μL TEMEDN,N,N,N’-四甲基乙二胺),充分混勻。
          9. 0.1 %硝酸銀染色液:0.5 g硝酸銀溶解于500 mL水中,置于棕色瓶中備用。
          10. 顯色液:取NaOH 10 gNa2CO3 0.2 mg,加入到500 mL蒸餾水中,使其充分溶解,用時(shí)再加入甲醛500 μL。
          11.變性上樣液:95% 甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚藍(lán)、 20mM EDTA(pH 8.0)
           
          二、操作步驟
          ⒈ PCR擴(kuò)增
              反應(yīng)總體積為10μl,在0.5ml微量離心管中加入下列反應(yīng)成分:
              10×buffer     1μl
              dNTPmix        70μM
              DNA模板          100ng
              引物及Taq DNA酶   依實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求按比例加入
              α-32P­-dCTP   0.1μl
              ddH2O至       10μl
              按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)循環(huán)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增,獲取擴(kuò)增產(chǎn)物。
           
          聚丙烯酰胺凝膠電泳
          電泳槽玻璃板的處理:用洗滌劑清洗玻璃板,自來水反復(fù)沖凈洗滌劑,雙蒸水沖洗3次,晾干,95%乙醇擦拭,自然干燥。用棉簽沾取SigmaCote涂于玻璃的貼膠面上, 5~10min后再用軟紙擦拭除去多余的SigmaCote溶液。在兩塊玻璃內(nèi)的兩側(cè)放好襯條對齊,用固定夾夾緊兩塊玻璃,并用玻璃膠帶封邊。
          制膠:按照被分離DNA片段的大小、含量及玻璃板、襯條的大小決定凝膠的濃度與體積,一般來講使用5%~8%的凝膠較為合適。輕輕搖勻配制的膠液于真空抽氣(開始時(shí)要緩慢)除氣泡,加 35μl TEMED至聚丙烯酰胺混合液中,混勻。用10ml玻璃吸管或50ml注射器吸取膠液,將玻璃模具傾斜成60O角,緩慢注入兩玻璃板間的空隙中,直至灌滿模具頂部。立即插入相應(yīng)的點(diǎn)樣梳,(小心勿使梳齒下帶進(jìn)氣泡,并且不要將梳齒全部插入膠內(nèi),留約2mm梳齒于玻璃板上端,以免拔梳時(shí)把膠孔拔斷)。由于凝膠在聚合過程中有回縮,所以應(yīng)小心添加些膠液于梳子處,水平放置,室溫聚合1hr。將封口玻璃膠帶掀去,放入電泳槽,凹型玻璃貼緊電泳緩沖液槽,用大號固定夾固定住兩側(cè)。在上下電泳槽內(nèi)灌入 1×TBE電泳緩沖液。小心取出點(diǎn)樣梳,用槽內(nèi)的緩沖液反復(fù)沖洗點(diǎn)樣孔,以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和氣泡。
          擴(kuò)增產(chǎn)物的處理:將 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與變性上樣液按1:5的比例加入0.5ml 微量離心管中,混勻。樣品上膠前應(yīng)98 o C變性10min,立即冰浴驟冷。取約3~5μl變性樣品(根據(jù)點(diǎn)樣孔的大小決定上樣量),以微量加樣器上樣,(上樣時(shí)要注意不要有氣泡沖散樣品,而且速度要快,時(shí)間長了樣品易于擴(kuò)散)。
          電泳:電泳槽接上電極(上槽接負(fù)極,下槽接正極)開啟電源,根據(jù)擴(kuò)增片段的大小及電泳槽和凝膠的大小,決定電泳的電壓及電泳時(shí)間。通常室溫下以l~5V/cm電泳。
          剝膠:電泳結(jié)束后,倒棄電泳緩沖液,取下電泳膠玻璃,用塑料楔子從玻璃板底部一角小心分開玻璃,凝膠應(yīng)附著在一塊玻璃上,切去凝膠左上角,作為點(diǎn)樣順序標(biāo)記。剪一張與玻璃同樣大小的濾紙,嚴(yán)密覆蓋于凝膠上,順一個(gè)方向?qū)⒛z緩慢取下,用保鮮膜蓋于膠面并包好,避免膜和膠之間產(chǎn)生氣泡或皺折,將凝膠固定在X線片夾中。
          放射自顯影:在暗室中將X線片貼于膠面,蓋嚴(yán)片夾,用黑布將X線片夾包裹,置-70℃放射自顯影。曝光時(shí)間根據(jù)同位素的強(qiáng)度而定,約 24h~10d。
          沖洗膠片從-70℃取出X線片夾,在暗室內(nèi)迅速取出X線片,立即顯影,以免使X線片上出現(xiàn)過多的冷凝水。(如果想再得到一張放射自顯影影像,可立即在片夾中裝一張新X線片并盡快放回到一70℃繼續(xù)顯影。如果來不及再加入新片即已出現(xiàn)冷凝水則應(yīng)使樣品凝膠和X線片夾都恢復(fù)到室溫,并擦去冷凝水后再裝入新的X線片)。依次按以下程序操作進(jìn)行顯影:
              X線片顯影液顯影          1-5min
              水洗                     lmin
              定影液定影               5min
              流動(dòng)水沖洗               15min
              所有使用液的溫度應(yīng)為18~20℃為宜。
           
          三、注意事項(xiàng)
          核酸片段的大小: 用于SSCP分析的核酸片段越小,檢測的敏感性越高。對于<200bp的片段,SSCP可發(fā)現(xiàn)其中70%的變異;對于300bP左右的片段則只能發(fā)現(xiàn)其中50%的變異;而>500bp的片段,則僅能檢出10%~3O%的變異,因此,<300bP,尤其是150bP左右的核酸片段更適于SSCP分析。對于大于400bp的PCR產(chǎn)物就需要設(shè)法進(jìn)一步處理,可以用限制性酶消化PCR產(chǎn)物,產(chǎn)生小于400bP的DNA片段,再進(jìn)行SSCP分析?!?/span>
          游離引物: 游離引物可能同 PCR產(chǎn)物結(jié)合而改變其泳動(dòng)率,即使游離引物量為6nM都有明顯影響。因此,應(yīng)盡可能除去游離引物。可以采用不對稱引物擴(kuò)增方法,盡可能消耗多余的引物。也可以運(yùn)用過柱或磁性球方法純化PCR產(chǎn)物?;蛘呤窍♂孭CR產(chǎn)物,減少游離引物的干擾。
          低濃度變性劑: 凝膠中加入低濃度的變性劑,如5%-10%甘油、5%尿素或甲酸胺、10%二甲亞砜(DMSO)或蔗糖等有助于提高敏感性,可能是因?yàn)檩p微改變單鏈DNA的構(gòu)象,增加分子的表面積,降低單鏈DNA的泳動(dòng)率。但有些變異序列卻只能在沒有甘油的凝膠中被檢出。因此,對同一序列使用2~3種條件做SSCP,可能提高敏感性。
          電泳溫度: 一般認(rèn)為保持凝膠內(nèi)溫度恒定是SSCP分析最關(guān)鍵的因素,溫度有可能直接影響DNA分子內(nèi)部穩(wěn)定力的形成及其所決定的單鏈構(gòu)象,從而影響突變的檢出。室溫下電泳適于大多數(shù)情況,但由于在電泳時(shí)溫度會(huì)升高,為確保電泳溫度相對恒定,應(yīng)采取以下措施:減少凝膠厚度,降低電壓,有效的空氣冷卻或循環(huán)水冷卻等。
          凝膠的長度: 可用測序板進(jìn)行SSCP分析,凝膠板長度在40cm以上。
          凝膠濃度及厚度: 凝膠濃度很重要,一般使用5%~8%的凝膠,凝膠濃度不同,突變帶的相對位置也不相同,如果在進(jìn)行未知突變種類的SSCP分析時(shí),最好采用兩種以上凝膠濃度,這樣可以提高突變種類的檢出率。凝膠的厚度對SSCP分析也很重要,凝膠越厚,背景越深,在上樣量較多的前提下,盡量使凝膠越薄越好。
          假陰性: 一般認(rèn)為,如沒有污染,PCR-SSCP分析不存在假陽性結(jié)果,但可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果,后者是由于點(diǎn)突變引起的空間構(gòu)象變化甚微,遷移率相差無幾所致,尤其是點(diǎn)突變發(fā)生在擴(kuò)增片段的兩端時(shí)。如果有陽性和陰性對照,結(jié)果可以重復(fù)確定的突變帶是可信的,如果沒有陽性對照,應(yīng)經(jīng)測序來確定其是否為突變帶。由于PCR-SSCP的不足之處主要是可能檢出假陰性結(jié)果。應(yīng)通過設(shè)置陽性對照,摸索電泳條件,假陰性結(jié)果在很大程度上是可以避免的。但對未知基因變異的檢測,假陰性結(jié)果就難以百分之百地消除。
              8. 結(jié)果分析: 單鏈凝膠電泳時(shí),互補(bǔ)單鏈遷移率不同,一般形成兩條單鏈帶。PCR產(chǎn)物進(jìn)行單鏈凝膠電泳之前,通過加熱變性產(chǎn)生單鏈。如變性不徹底,殘留雙鏈亦可形成一條帶.因此,PCR-SSCP分析結(jié)果至少顯示三條帶。但是,由于一種DNA單鏈有時(shí)可形成兩種或多種構(gòu)象,檢出三條或四條單鏈帶就不足為奇。

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