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一.熒光PCR原理
1.熒光共振能量傳遞 (FRET) 某熒光標(biāo)記基團(tuán)在激發(fā)光刺激下生成某波長的發(fā)射光,當(dāng)另一屏蔽基團(tuán)與其距離合適時(shí),原發(fā)射光將會被屏蔽基團(tuán)所吸收,并轉(zhuǎn)化為其他波長的發(fā)射光或熱能,稱之為FRET。 2.熒光化學(xué): 熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種:熒光探針和熒光染料。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個報(bào)告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時(shí),Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。 二.實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)靶基因的確定及引物和探針的設(shè)計(jì)原則 1.靶基因的確定:選擇檢測組共有的基因以避免檢測的假陰性(漏檢)。 2.檢測片段的確定:選擇檢測組內(nèi)的保守 (突變少)(避免假陰性)、組間特異的序列 (突變多)(避免假陽性)作為引物探針的設(shè)計(jì)位置。片段長度70-150bp。 3.引物:長度17-25bp;GC含量30-80%;退火溫度(Tm值)58-60℃;避免穩(wěn)定的引物二聚體(特別是多聯(lián)檢測)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)(自由能大于-3.5kc/m);序列不能出現(xiàn)連續(xù)的G,3’端避免G或C,最后5個堿基內(nèi)避免兩個以上的G或C。 4.探針:長度20-30bp(Taqman)或16-25bp(MGB);GC含量30-80%;Tm值為68-70℃;避免穩(wěn)定的二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu) (自由能大于-3.5kc/m);5’端不能是G;位置盡量靠近上游引物;選擇波長差異較大(多聯(lián)檢測)或Fam(單聯(lián)檢測)的熒光標(biāo)記。 三.特點(diǎn)和優(yōu)勢 1.特異性強(qiáng):引物和探針的“雙保險(xiǎn)”,避免檢測的假陽性。 2.靈敏度高:分析PCR產(chǎn)物的對數(shù)期,自動化儀器收集熒光信號,避免了許多人為因素干擾。 3.避免污染:全封閉反應(yīng),無須PCR后處理。 4.實(shí)現(xiàn)定量:運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)品獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)合Ct值進(jìn)行準(zhǔn)確定量。 5.高效低耗:可實(shí)現(xiàn)一管多檢。 6.操作簡便:在線式實(shí)時(shí)監(jiān)測擴(kuò)增結(jié)果,不必接觸有害物質(zhì)。 7.快速:反應(yīng)時(shí)間<1.5小時(shí)。 四.實(shí)用意義: 1.提高檢測效率,縮短檢測周期,提高通關(guān)速度; 2.降低檢測成本,提高經(jīng)濟(jì)與社會效益。 |
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