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          生物知識

          PCR技術(shù)應(yīng)用八:DMS/BMD基因診斷

          作者:admin 來源:本站 發(fā)布時間: 2011-01-05 11:07  瀏覽次數(shù):
          購買進口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 m.kjhfd.cn

          DMD(Duchenne Muscular Dystrophy)和BMD(Becker Muscular Dystrophy)是一種常見的X連鎖隱性遺傳病,主要發(fā)生于男性,其發(fā)病率為1/3500活產(chǎn)男嬰,其發(fā)生的原因是Dystrophin(抗肌萎縮蛋)其固缺陷所致.

          一、DMD/BMD的臨床表現(xiàn)

            在臨床上DMD較BMD常見,發(fā)病早,癥狀重,正常于2-3歲即出現(xiàn)骨骼肌無力的表現(xiàn),一般從骨盒帶肌肉無力開始而出現(xiàn)一系列的特殊癥狀:走路困難呈鴨步,出現(xiàn)Gower's征,腓腸肌進行性肥大.逐漸出現(xiàn)心肌細胞受損,約30%的小兒智能力缺陷.在12歲左右失去能力,至20歲時正常死于呼吸衰竭和心力衰竭.而BMD相對來說癥狀較輕,進展亦較慢.

          二、DMD/BMD的遺傳病

            (一)遺傳方式:X-連鎖隱性遺傳,發(fā)病者多為男性,其母親為致癌基因攜帶者,尚有1/3的患者為散發(fā)病例,則新生突變引起.

            (二),DMD/BMD的致病基因:1.基因定位:DMD/BMD是因位于Xq21,其基因非常大約為2400Kb.2.基因結(jié)構(gòu):該基因共有79個外顯子,78個內(nèi)含子,其CDNA全長約為13974個時,編碼的肽鏈含3685aa殘基,編碼蛋白命名為dystrophine,其基本5個獨立的啟動子,在DMD基因內(nèi)還存在一些STR,已知有13個STR,其中5'端編碼區(qū)有8個,3'端編碼區(qū)有1個,44,45,49,30,50內(nèi)含子各有一個STR,是多為DNDR核心是(CA)n.等位基因數(shù)目為2-19個.

          三、DMD基因的突變類型

            (一)缺失與重復(fù):研究表明約65%的DMD/BMD是由于基因內(nèi)的部分缺失所致,尚有12.5%病例有基因內(nèi)重復(fù),這種突變變有兩個高頻發(fā)生區(qū),一個在基因的5端,另一個大致在第45~55外顯子區(qū)域,而5'端的缺失重復(fù)熱點大致在第1~7外顯子區(qū)域.缺失的范圍從1至數(shù)個外顯子,甚至整個DMD基因亦可發(fā)生缺失,啟動子區(qū)亦有缺失發(fā)生.

            (二)單堿量換:近年來的研究還發(fā)現(xiàn),在DMD基因內(nèi)尚有單堿其置換,目前已發(fā)現(xiàn)的約有6種,根認為在DMD患者中由此型突變引起者占30%左右.

            (三)基因內(nèi)連接形成和mRNA剪接異常:以上兩種類型的突變亦在DMD人群中有抗,但因研究的病印例尚少,需要進上步的研究.

          四、利用PCR技術(shù)診斷DMD的途徑

          (一)用PCR技術(shù)檢測缺失型突變.

            利用PCR可直接檢出DMD/BMD的缺失型突變,由于DMD/BMD發(fā)生時,其65%的患者為基因缺失所致,因此直接檢測缺失可使65%的患者得到診斷.在DMD/BMD基因的缺失中,其缺失范圍,缺失的位置具有高度異質(zhì)性,加之DMD/BMD基因較大,很難用一對引物確定其缺失部位,隨著DMD/BMD基因的克隆及其精結(jié)構(gòu)的闡明,有人開發(fā)了多時引物進行多重PCR,從而可使幾乎全部的缺失型DMD/BMD得到診斷.

            1.利用6對引物擴增處于缺失熱點區(qū)域的6個外顯子,即外顯子8,16,19,44,45和48,再加上外顯子4,12,51的3對引物,可檢測80%的缺失,若再用Beggs等設(shè)計的另外九對引物即外顯子3,6,13,46,47,49,50,52,30,60及啟動子的引物,進行多重PCR,可使98%的缺失型患者得到診斷,各引物的序列及擴增片段大小見表.

            在用多重PCR進行DMD/BMD基因的缺失型檢測時方便簡便,快速,在擴增后,用瓊脂糖凝膠電泳溴乙錠染色可根據(jù)擴增產(chǎn)物的有無判斷結(jié)果.擴增時的分清情況見下表:

          DMD基因PCR擴增引物

          外顯子
          引物序列(5'--3')
          產(chǎn)物片段
          Pm
          GAAGATCTAGACAGTGGATAC
          ATAACAAATGCATG
          535
           
          TTCTCCGAAGGTAATTGCCTC
          CCAGATCTGAGTCC
           
          3
          TCATCCATCATCTTCGGCAG
          ATTAA
          410
           
          CAGGCGGTAGAGTATGCCA
          AATGAAAATCA
           
          4
          TTGTCGGTCTCCTGCTGGTC
          AGTG
          196
           
          GAAAGCCCTCACTCAAAC
          ATGAAGC
           
          6
          CCACATGTAGGTCAAAAA
          TGTAATGAA
          202
           
          GTCTCAGTAATCTTCTTAC
          CTATGACTATGG
           
          8
          GTCCTTTACACACTTTAC
          CTGTTGAG
          360
           
          GGCCTCATTCTCATGTTC
          TAATTAG
           
          12
          GATAGTGGGCTTTACTTA
          CATCCTTC
          331
           
          GAAAGCACGCAACATAA
          GATACACCT
           
          13
          AATAGGAGTACCTGAGAT
          GTAGCAGAAAT
          238
           
          CTGACCTTAAGTTGTTCT
          TCCAAAGCAG
           
          17
          GACTTTCGATGTTGAGAT
          TACTTTCCC
          416
           
          AAGCTTGAGATGCTCTCA
          CCTTTTCC
           
          19
          TTCTACCACATCCCATT
          TTCTTCCA
          459
           
          GATGGCAAAAGTGTTG
          AGAAAAAGTC
           
          43
          GAACATGTCAAAGTCA
          CTGGACTTCATGG
          357
           
          ATATATGTGTTACCTAC
          CCTTGTCGGTCC
           
          44
          CTTGATCCATATGCTTT
          TACCTGCA
          268
           
          TCCATCACCCTTCAGA
          ACCTGATCT
           
          45
          AAACATGGAACATCCT
          TGTGGGGAC
          547
          CATTCCTATTAGATCTG
          TCGCCCTAC
           
          47
          CGTTHTTHCSTTTHTCT
          HTTTCAGTTAC
          181
           
          GTCTAACCTTTATCCA
          CTGGAGATTTG
           
          48
          TTGAATACATTGGTTA
          AATCCCAACATG
          506
           
          CCTGAATAAAGTCTT
          CCTTACCACAC
           
          49
          GTGCCCTTATGTACCA
          GGCAGAAATTG
          439
           
          GCAATGACTCGTTAAT
          AGCCTTAAGATC
           
          50
          CACCAAATGGATTAA
          GATGTTCATGAAT
          271
           
          TCTCTCTCACCCAGT
          CATCACTTCATAG
           
          51
          GAAATTGGCTCTTTA
          GCTTGTGTTTC
          388
           
          GGAGAGTAAAGTGA
          TTGGTGGAAAATC
           
          52
          AATGCAGGATTTGGA
          ACAGAGGCGTCC
          113
           
          TTCGATCCGTAATGA
          TTGTTCTAGCCTC
           
          60
          AGGAGAAATTGCGCC
          TCTGAAAGAGAACG
          139
           
          CTGCAGAAGCTTCCA
          TCTGGTGTTCAGG
           

          ()單個堿基置換的檢測

            單堿是置換在DMD/BMD的發(fā)生中占有重要地位,但DMD/BMD是因單堿基置換近年來才受到人們的重視,它對發(fā)現(xiàn)新突變,確定單堿基置換與DMD/BMD發(fā)生的關(guān)系具有重要意義,推測的方法主要是用RT-PCR-SSCP及全套式RF-PCR檢測.

          ()利用PCR-RFLPAmp-FLP進行連鎖分析診斷DMD/BMD

            若在一個家庭中,已有一個先證者,則首先利用多重PCR檢測其缺失,若不能確定其缺失的部位或不能診斷,或其它條件所限,則可用PCR-RFLPAmp-FLP進行連鎖分析,確定風(fēng)險染色體.

            1.PCR-RFLP

            用多重PCR不能檢出非缺失型DMD/BMD患者及攜帶者,現(xiàn)在可用PCR方法擴增多態(tài)性位點區(qū)域,同適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶酶解擴增產(chǎn)物,電泳分離后可對多態(tài)性位點進行分布,利用PCR-RFLP連鎖分析,即可進行DMD/BMD風(fēng)險個體的攜帶者的檢出,下表序列即為常用的幾個多態(tài)性位點檢測時的引物及擴增酶解情況.

          擴增區(qū)域
          引物序列
          限制性酶
          擴增產(chǎn)物
          水解片段
          PERT87-1 5'GTCAGTTGGTCAGT
          AAAAGCC3'
          B5N 400bp 400/250150
          PERT87-8 5'CCAATTAAAACCA
          CAGCAG3'
          Taq 155bp 14510/74
          7110
          pERT87-15 5'GACTGGAGCAAGG
          GTCGCC3'
          Xma 740bp 73010/520
          21010
          PERT87-15 5'ACAATTTCCCTTT
          CATTCCAG3'
          BamH 226bp 21610/166
          5010
          MPIP 5'TCCAGTAACGGA
          AAGTGC3'
          Alu 60bp 60/56or52
          841Q 5'ATAATTCTGAATA
          GTCACAAAAG3'
          Mae 252bp 23616/128
          10816

            2.AmP-FLP

            在DMD/BMD基因區(qū)內(nèi)有多個(CA)n重復(fù)區(qū)域,這些區(qū)域可用OCR方法進行擴增,增產(chǎn)物同聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)進行分析擴增片段大小,然后與先證者及母親進行對比,亦是檢出患者與攜帶者的理想多態(tài)性標(biāo)記,現(xiàn)將在我國人群中已作分析的(CA)n區(qū)引物及多態(tài)性片段,PIC列表示下:

          位置
          名稱
          等位基因
          引物序列
          片段
          PIC
          5'腦組織特異啟動子
          DYS-
          8
          F5'TCTTGATATATAGGGA
          TTATTTGTGTTTGTTATAC
          214-218 0.750
           
           
           
          R5'ATTATGAAACTATAAG
          GAATAACTCATTTAGC
             
          3'非翻譯區(qū)
          3'CA
          4
          F5'GAAAGATTGTAAACTA
          AAGTGTGC
          119-137 0.375
           
           
           
          R5'GGATGCAAAACAATG
          CGCTGCCTC
             
          內(nèi)含子
          44CA
          9
          F5'TCCAACATTGGAAAT
          CACATTTCAA
          174-204 0.072
           
           
           
          R5'TCATCACAAATAGAT
          GTTTCACAG
             
           
          45CA
          7
          F5'GAGGCTATAATTCTTT
          AACTTTGGC
          156-184 0.772
           
           
           
          R5'CTCTTTCCCTCTTTAT
          TCATGTTAC
             
           
          49CA
          11
          F5'CGTTTACCAGCTCAA
          ATCTCAAC
          227-257 0.870
           
           
           
          R5'CATATGATACGATTC
          GTGTTTTGC
             
           
          50CA
          4
          F5'AAGGTTCCTCCAGTA
          ACAGATTTGG
          233-251 0.718
           
           
           
          R5'TATGCTACATAGTAT
          GTCCTCAGAC
             

            不應(yīng)用內(nèi)含子進行連鎖分析時,可用44/49,45/50兩組雙重PCR同時擴增,亦可在這些組中,將缺失熱點的引物加入,形成多復(fù)PCR,連鎖分機與缺失檢測同時進行.

          五、DMD/BMD的PCR快速前診斷

            過去DMD/BMD的PCR快速產(chǎn)前基因診斷主要采用RFLP連鎖分析,由于該方法探作復(fù)雜費時,提供的信息量有限,因此不能滿足臨床診斷的要求,目前主要應(yīng)用PCR法進行產(chǎn)前診斷.

          產(chǎn)前快速基因診斷常用以下兩種途徑

            1.四步法:

            (1)性別確定.━━(SRY引物+DMD課題內(nèi)對照)

            (2)先證者缺失型基因檢測(多重PCR)

            (3)胎兒缺失型的確定(多重PCR+單對引物PCR)

            (4)Amp-FLP+PCR-RFLP確定非缺失型式攜帶者

            2.一步列位法:董尚志等人在上述方法的基礎(chǔ)上建立了一步到位快速法,該系統(tǒng)包括以下三組多重PCR體系.

            ①5'pmCA+e12+MP1P

           ?、趀17+44CA+49CA

           ?、踖17+45CA+50CA

            應(yīng)用上述三組多重PCR不僅可將女性的兩條×染色體分開.而且能檢出染色體的.另有一組,SRr+e44定胎兒性別及44外顯子的缺失.一步到位法快速,方便,它不僅能檢測缺失,亦可對非缺失型的DMD/BMD進行連鎖分析.

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