<mark id="bahkc"><acronym id="bahkc"></acronym></mark>

          国产精品久久久久久不卡_欧美激情精品久久_99久久免费精品国产72精品九九_精品熟人妻一区二区三区四区不卡_国产麻豆精品一区二区三区

          ?
          生物知識(shí)

          PCR技術(shù)應(yīng)用五:苯酶同尿癥診斷

          作者:admin 來(lái)源:本站 發(fā)布時(shí)間: 2011-01-05 11:05  瀏覽次數(shù):
          購(gòu)買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 m.kjhfd.cn

          經(jīng)典型的苯丙酮尿(Phenyketon uria簡(jiǎn)PKU)是由苯丙氨酸羥化酶(PAH)的遺傳性 缺陷引起的一種先天性代謝病,其發(fā)病早在我國(guó)以為1/10000左右,雜合子頻率為 1/50.

          PKU的臨床表現(xiàn)

            PKU患兒由于苯丙氨酸羥化酶的缺乏或不是使苯丙氨酸在休丙大量堆識(shí),并經(jīng)旁 路代謝途徑產(chǎn)生一系列的毒性代謝產(chǎn)物而該小兒產(chǎn)生一系列的明顯中毒癥狀.患兒在 剛出生時(shí),由于無(wú)苯丙氨酸的攝入因此無(wú)臨表現(xiàn).隨著患兒的退食而連續(xù)出現(xiàn)智力進(jìn) 行性下降,皮膚色素淺,肌張力高,驚厥發(fā)生,汗和尿中有特殊的臭味,最經(jīng)生活不 能自理,智力嚴(yán)重障礙.

          PKU的遺傳學(xué)

            PKU是一種常染色體隱性遺傳病,患兒的父母為致病基因的攜帶者而患兒為純合 子.引起PKU的基因的PAH,該基因位于12q22-24.2全長(zhǎng)約90kb,包括13個(gè)外顯子和12 個(gè)內(nèi)含子.內(nèi)切酶解分析顯示PAH的完整cDNA其有8個(gè)限制性內(nèi)切酶切點(diǎn),形成10個(gè) RFLP.在人群中這些RFLP可組成1536種單倍型.過(guò)去對(duì)PKU的診斷即用此連鎖分析.另外 在PAH基因內(nèi)含有數(shù)個(gè)VNTR和STR.外顯子3'鎖700bp處有-(TCTA)重復(fù)序列,外顯子 133'端下游3kb內(nèi)有-30bpVNTR,它們?nèi)杂惺畴s的遺傳病多態(tài)現(xiàn)象,可用為連鎖分析時(shí) 的標(biāo)記.

          PAH基因突變類型

           PAH基因的突變常見(jiàn)的有兩種類型即缺失和單堿基置換,在我國(guó)人群中,已檢測(cè)的 PKU均因PAH基因的單堿基量換所致.目前在我國(guó)其檢出了15種以上的點(diǎn)突變6見(jiàn)表,這 些點(diǎn)突變?cè)谖覈?guó)南方和北方人群中的頻率有的不同.因此在PKU的診斷中注意這種差別.

          中國(guó)人已檢出的PAH基因點(diǎn)突變

          突變位點(diǎn)代號(hào) 所外的外顯子 突變性質(zhì)
          E56D 2 GT
          R111X 3 CT
          IVS4nt-1 4 GA
          F161S 5 TC
          Y204C 6 AG
          R243Q 7 GA
          G247V 7 GT
          L255V 7 TC
          R261Q 7 GA
          IVS7n2 7 GT
          W326X 10 GA
          A345T 10 GA
          Y356X 11 GA
          R413P 12 GC
          T418P 12 AC

          PAH基因點(diǎn)突變的PCR檢測(cè)

          (一)PCR-ASO斑點(diǎn)雜交

            在我國(guó)人群中,目前所發(fā)現(xiàn)的PAH基因突變以點(diǎn)突變?yōu)橹?,因此可以此?lái)合成相 應(yīng)的突變型寡核苷酸探針.來(lái)檢測(cè)PKU患者的點(diǎn)突變,ASO法是最為有效的點(diǎn)突變檢測(cè) 技術(shù).隨著非同位素標(biāo)記探針的出現(xiàn)及反向斑點(diǎn)雜交的應(yīng)用,預(yù)記該方法的臨床應(yīng)用 將愈來(lái)愈廣泛.下表訓(xùn)列即為利用PCR-ASO檢測(cè)時(shí)所用的引物.

          探針

          突變位置及 性質(zhì)
          擴(kuò)增 區(qū)域
          引物
          擴(kuò)增 片段
          突變探針
          R111×(CT) 3 F5'GTTAGGTTTTCCT GTTCTGG3' 300bp 35'GAGCTTTCATGA GATAAGA3'
              R5'CTTATGTTGCAA AATTCCTC3'   35'GAGCTTTCACGA GATAAGA3'
          Y204C(AG) 6 F5'CACAGGTTCTGG TCCCCGAC3' 354bp 65'TTGTACTCACAG CAAGCAT3'
              R5'CTCTCCTCTCCT CAATCCTC3'   65'ATGCTTGCTATGA GTACAA3'
          R243Q(GA) 7 F5'CTCCTAGTGCCT CTGACTCA3' 291bp 705'TTCCGCCTCCAA CCTGT3'
              R5'ACCAGCCAGCA AATGAACCC3'   75'TTCCGCCTCCGAC CTGT3'
          W326X(GA) 10 F5'CCCAGTCAAGG TGACACATA3' 256bp 105'ACAGTAAACTAG TAAAT3'
              R5'ACAAATAGGGTT TCAACAAT3'   105'ATTTACTGGTTTA CTGT3'
          Y356X(CA) 11 F5'TGAGAGAAGGGG CACAAATG3' 320bp 115'CTACAGTAATGC TTATC3'
              R5'GTAGACATTGAG TCCACTCT3'   115'CTACAGTACTGC TTATC3'
          R413P(GC) 12 F5'ATGCCACTGAGA ACTCTCTT3' 245bp 125'GGTCGTAGGGAA CTGAG3'
              R5'AGTCTTCGATTA CTGAGAAA3'   125'GGTCGTAGCGAA CTGAG3'

            擴(kuò)增時(shí)所用引物系根據(jù)每個(gè)外顯子兩側(cè)的旁側(cè)序列的設(shè)計(jì).擴(kuò)增片段包括完整的 外顯子區(qū)域其兩側(cè)部分內(nèi)含子序列.

          (二)3'-堿基特異PCR,高位特異PCR

            在以PCR為主的已知突變檢測(cè)中,3'BSPCR是最簡(jiǎn)便可行的一種檢測(cè)技術(shù).在應(yīng)用 時(shí),采用正常引物和突變引物兩組試驗(yàn),以確定何種引物可擴(kuò)增,然后電泳確定有無(wú)相應(yīng)的突變. 由個(gè)PAH各外顯子間的距離較大,各自有獨(dú)立的引物,因此可用多重PCR同時(shí)擴(kuò)增數(shù) 個(gè)外顯子.不應(yīng)同時(shí),可將正常引物編為一組,突變引物編為一組進(jìn)行兩組多滲PCR. 然后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物以確定突變位點(diǎn).

            表所到即為國(guó)內(nèi)報(bào)道的用等位特異PCR

          診斷PKU后用的相物及擴(kuò)增片段,檢測(cè)位置

          外顯子 及位置
          共同引物
          正常引物
          突變引物
          C/N
          C/M
          3, R111× (CT) (CGATGA) C:5'TCTAGAC CTTCTCG-3' N:5'-TTCTTCT TATCTCG-3' M:5'-CTTTCTT CTTATCTCA-3' 147 148
          6Y204 (AG) (TATTGT) C:5'-AGCCCA TCCCTCGA-3' N:5'-ATGTGAT TGTACTCAT-3' M:5'-AATGTGA TTGTACTCAC-3' 114 113
          7, R243Q (GA) (CGA CAA) C:5'-CAGTAC TCACGGTTCG-3' N:5'-GTTTCCGC CTCCGA-3' M:5'-GGTTTCC GCCTCCA-3' 138 137
          11, Y356X (CA) (TAC TAA) C:5'-TCTCTG CCACGTAA-3' N:5'-TGGGGCC TACAGTAC-3' M:5'-TGGGGCC TACAGTAA-3' 118 118
          12R413P (GC) (CGC CCC) C:5'-TACTGT TAATGGAATC-3' N:5'-CCCTTCTC AGTTCG-3' M:5'-CCCTTCT CAGTTCC-3' 94 94

          (三)用PCR直接檢測(cè)發(fā)生點(diǎn)突變的內(nèi)切酶點(diǎn)

            在PKU已檢出的突變位點(diǎn)中,有七個(gè)位點(diǎn)的突變改變了限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn). 若用該酶切位點(diǎn)兩側(cè)的引物擴(kuò)增包括內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)在內(nèi)的DNA的酶,然后將擴(kuò)增產(chǎn)物用內(nèi)切酶 溶解,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離酶切點(diǎn)段,以判定個(gè)體有無(wú)該內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的突變,引起內(nèi)切酶識(shí)別 位點(diǎn)改變的點(diǎn)突變見(jiàn)

          基因突變類型
          擴(kuò)增區(qū)域
          內(nèi)切酶
          識(shí)別位點(diǎn)
          突變結(jié)果
          F56(GT)
          2
          Mn CCT(N) 消失
          R111×(TT)
          3
          BspH TCATGA 出現(xiàn)酶切位點(diǎn)
           
           
          NLa CATG  
          IVS4n(CA)
          5
          Mae CTAG 消失
           
           
          Dne CTNAG 新切點(diǎn)出現(xiàn)
          G247V(GT)
          7
          Hae GGCC 消失
          W326×(GA)
          10
          Dde CTNAG 出現(xiàn)新切點(diǎn)
          A345T(GA)
          10
          Rsa GTAC 出現(xiàn)新切點(diǎn)
          Y356×(CA)
          11
          Rsa GAC 消失

          (四)新的突變位點(diǎn)的PCR篩查:

            對(duì)于有患者,不夠用上述的PCR方法檢出其突變位點(diǎn),則可用PCR-SSCP,PGGECDGE及其它的突變位點(diǎn)篩查技術(shù)進(jìn)行篩查,以確定檢出的突彎位點(diǎn)與PKU的關(guān)系.

          PKUPCR診斷的途徑

            (一)利用PCR-ASO檢測(cè),近年來(lái)又發(fā)展了反向點(diǎn)雜交及非同位標(biāo)記探針,與PCR-A SO應(yīng)用起來(lái)更為方便,它是檢測(cè)PKU點(diǎn)突變的最為手段之一.

            (二)利用等位特異PCR(ASPCR)

            若將ASP-PCR與多重PCR結(jié)合,形成MASP-PCR則一見(jiàn)可檢測(cè)多個(gè)突變位點(diǎn),要是一 個(gè)非常有效的PKU診斷手段.

            (三)利用PCR-RFLP診斷

            由于某些突變涉及到酶切位點(diǎn)的變化,因此右PCR-RFLP進(jìn)行診斷PKU.

          PCR在PKU的產(chǎn)前診斷斷中的應(yīng)用

            由于PKU的治目前沿?zé)o有效的方法,因此其產(chǎn)前診斷,防止PKU患兒的出生具有重 要的意義,在PKU的產(chǎn)前診斷中,RFLP是較為傳統(tǒng)的診斷方法,操作費(fèi)時(shí),不能及時(shí) 提供臨床診斷信息,而且有相當(dāng)大的一部分不能提供信息加止還要用同位素標(biāo)記的探 針進(jìn)行操作,因而大大的限制了其原因,應(yīng)用PCR技術(shù)診斷PKU快速準(zhǔn)確,易于滿足臨 床需要,而是便于推廣應(yīng)用.

          (一),PCR-ASO

            傳統(tǒng)的PCR-ASO及類似的診斷方法盡管準(zhǔn)確有效,但操作復(fù)雜,往往需要進(jìn)行多 次操作,確診一測(cè)頗為費(fèi)時(shí),近年來(lái)應(yīng)用的反向點(diǎn)雜交法(reverse dot bolt RDD), 改變了傳統(tǒng)的點(diǎn)雜交程序,因而該其檢測(cè)時(shí)程明顯縮短,操作也較簡(jiǎn)化.RDB是將一系 列的ASO探針先固定于膜上,然后用擴(kuò)增的靶DNA與之雜交,在應(yīng)用時(shí),可將一些較為 常見(jiàn)的點(diǎn)突變探針固定于同一膜,而少見(jiàn)的固定于同一膜,因此結(jié)束分析樣品最多只 需雜產(chǎn)兩次即可完成PKU的診斷,在這種情況下,即使無(wú)證者一亦可進(jìn)行產(chǎn)前診斷.

          (二)MASP.PCR

            采用MASPPCR亦是進(jìn)行已知PAU突變點(diǎn)基因產(chǎn)前診斷的簡(jiǎn)易方法之一.

          (三)AmPFLP+PCR-SSCP快速診斷

            盡管采用PCR-ASO和MASP-PCR可檢測(cè)全部的常見(jiàn)的PAH基因的已知點(diǎn)突變,但它只 能診斷約70~80%的PKU患者及浸入,仍有相當(dāng)一部分不能同上述方法進(jìn)行產(chǎn)前診斷, 我國(guó)董尚志等人利用PAH是國(guó)內(nèi)的STP及VNTR作為多態(tài)性標(biāo)記結(jié)合PCR-SSCP進(jìn)行產(chǎn)前診 斷,其診斷的準(zhǔn)確率可達(dá)90%左右診方法包括以下幾步.

            1.Amp-FLP連鎖分布:等用PAH基因內(nèi)含子中-STR多態(tài)性進(jìn)行分析,可次66.2%的家之獲得有用的診斷信 息,其引物序列為:可擴(kuò)增片段大小范圍為,擴(kuò)增完畢合用變性膠(尿素)PAG電泳分析 擴(kuò)增長(zhǎng)產(chǎn)物的片段多態(tài)性和先證者及攜帶者對(duì)照,確定胎兒的基因組合,以判斷是否 為PKU患兒,若用連鎖分析不能診斷則進(jìn)入下步

            2.外顯子4PCR-SSCP

            3.外顯子7,11,12SSCP分析:通過(guò)上述3步分析,診斷常可達(dá)90%以上,該方法簡(jiǎn)使快速,準(zhǔn)確率多,極適合于 基礎(chǔ)應(yīng)用.若將PCR-ASORDB與Amp-FLP聯(lián)合應(yīng)用,則定確率定高,況且要進(jìn)行雜交,條 件及探治相對(duì)復(fù)雜,因此尚不夠廣泛推廣于臨床檢測(cè).

          購(gòu)買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 m.kjhfd.cn

          所有試劑均用于科研 ???? 北京畢特博生物技術(shù)有限責(zé)任公司 版權(quán)所有
          服務(wù)熱線:010-82015225/400-833-9299 | 傳真:010-62015131 | E-mail:info@bitebo.com
          京ICP備05028556號(hào)-1 ??京公網(wǎng)安備11010802008747??

          亚洲av无码乱码在线观看裸奔_欧美激情精品久久_99久久免费精品国产72精品九九_精品熟人妻一区二区三区四区不卡

          <mark id="bahkc"><acronym id="bahkc"></acronym></mark>