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購買進口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 m.kjhfd.cn |
自從1985年P(guān)CR技術(shù)首次應(yīng)用于遺傳病基因診斷以來,已有近百種遺傳病可用PCR 技術(shù)進行診斷和產(chǎn)前診斷,利用PCR技術(shù)診斷遺傳病的途徑有五個,①基因突變位點 的直接檢出②篩查與遺傳?、邰苡嘘P(guān)的點突變③遺傳多態(tài)性標(biāo)記連鎖分析間接診斷④ 利用cmRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進行分析或直接分析cmRNA. 傳統(tǒng)的基因診斷技術(shù)主要是以基因探針技術(shù)為基礎(chǔ)而建立的一些檢測方法,包括 Southerninnouthern印跡雜交,RFLP為,它們可直接分析基因的缺失和重排,亦可利 用RFLP時行連鎖分析,但由于這些技術(shù)操作繁瑣,探針來源困難所需設(shè)劑昂貴,且要 用同抗素.完成一項診斷需要的時間亦較長,因此難于滿足臨床診斷的要求.限制了它 在臨床上的應(yīng)用.PCR技術(shù)是一種在體外的海促DNA合成技術(shù),它能在短時間內(nèi)將靶DNA 擴增百萬倍,而且操用簡便,省時,準(zhǔn)確性也高,它不僅能直檢突變基因,而且可與 其它技術(shù)結(jié)合,使其診斷的準(zhǔn)確性幾達100%.而且不同同位素操作.能最大限度的滿足 臨床診斷的需要.因而它已成為目前遺傳病診斷的產(chǎn)前診斷的主要手段. 一、PCR技術(shù)診斷遺傳病的基本條件 PCR技術(shù)的基本原理是利用一對引物為介導(dǎo),在體外模擬天然DNA復(fù)制過程的技 術(shù),從生化的角度來看,它是一種海促反應(yīng),因此其反應(yīng)的過程中必須有酶的底物, 在這里酶為DNA聚合酶,沒酶是有耐熱性,底物為4種脫氯乙磷酸核菌酸.它所需要的 另一條件為引物,引物是根據(jù)已知的基因片段合成的一段20時左順的互解序列,因 此,要進行PCR檢測,除了具備酶,底物及其它基本因素外,利用已知的基因結(jié)構(gòu)合 成一對引物是PCR診斷遺傳病的最基本條件,也就是說,說遺傳病的基因結(jié)構(gòu)必須部 分或全部清楚. 二、利用PCR技術(shù)診斷遺傳病的途徑 (一)PCR技術(shù)直接診斷遺傳病 對于由基因缺失突變引起的遺傳病可利用缺失區(qū)域還側(cè)的DNA序列引物直接擴增 該區(qū)域,看有無特異性的擴增產(chǎn)物,這對缺失部位固定的片段檢測非常準(zhǔn)確簡便,只 需一對引物即可完成,而對于哪些缺失部位異質(zhì)的基因則可利用多對引物進行多重 PCR,然后檢查缺失帶.對基因的重排來說,可通過用RT-PCR檢測mRNA的融合情況來檢 出,括入亦可用PCR方法來檢出,當(dāng)點突變影響到限制內(nèi)性切酶切點時,可用PCR-RFL P進行分析,即將擴增產(chǎn)物用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶切割,然后據(jù)電泳圖譜復(fù)制判斷有無內(nèi)切 酶切點的改變,它比傳統(tǒng)的RFLP檢測法快速簡便,且不受同位素的危害.若突變優(yōu)點 及性質(zhì)已知.可用PCR-ASO,3'特異PCR及引物鐿爭法進行確定,而對于突變優(yōu)點不清 楚或突變優(yōu)點多變的基因則可用PCR-SSCP,DGGE,CDGE,TGGE,PCR-RNSE切割,化簡 錯配切割,異源雙鏈分析長久法進行篩選與遺傳病有關(guān)的點突變,再用PCR循環(huán)直接 測序確定突變部位和性質(zhì). (二)利用連鎖分析間接診斷遺傳病 在有的遺傳病其基因結(jié)構(gòu)龐大,基因的分子病理改變復(fù)雜或不清楚,或異質(zhì)性較 高,利用PCR技術(shù)直接檢測與遺傳病有關(guān)的基因點突變有一定的困難.常常利用一些基 因內(nèi)或其旁側(cè)的一些多態(tài)性標(biāo)記進行連鎖分析,以間接判斷遺傳病,常以PCR方法進 行檢測的多態(tài)性標(biāo)記有以下兩種. 1.PCR-RFLP 在人類基因組中存在著許多限制性內(nèi)切酶切點,這些切點在人群中具有明顯的遺 傳變態(tài)性.因此可用已知DNA序列的基因內(nèi)或其旁側(cè)序列中的酶切位點多態(tài)性以PCR方 法來檢測.PCR擴增后用相應(yīng)的內(nèi)切酶進行切割相應(yīng)的擴增產(chǎn)物,通過用瓊脂糖蔌聚丙 烯胺凝膠電泳技術(shù)進行電泳,分析酶切位點多態(tài)性,在家庭或黃間進行連鎖分析.需 要注意的是,在用PCR-RFLP進行連鎖分析時應(yīng)選擇那些雜合頻率多,即具有較高多態(tài) 信息量的酶切位點多態(tài)性.亦可采用多個多生酶切位點聯(lián)合應(yīng)用. 2.Amp-FLP 在人類基因組中,除RFLP可作為遺傳標(biāo)記外還有一有用的多態(tài)性標(biāo)記,即VNTR(數(shù) 目可變的串聯(lián)重復(fù)序列,和STR(短的串聯(lián)重復(fù)序列).VNTR的特征是其重復(fù)的核心區(qū)內(nèi) 的串聯(lián)重復(fù)單位為6-40nt,重復(fù)次斷在不同個體有所不同重復(fù)次數(shù)變化亦較大,一般 在幾次到上每次之間.STR的核心重復(fù)單痊為2-5時,其中由雙核苷酸重復(fù)(CA)n或(GT) n(n從10-60次)構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)稱為VNDR.有意義的是,這些串聯(lián)重復(fù)序列在人群中具 有高度的遺傳多態(tài)性,人群中的雜合子比例在50%以上,最高的可達90%以上,因此它 仍可提供更多的多態(tài)信息量.VNTR和STR可用其兩端的序列合成引物,用PCR進行擴 增,PAGE+銀染堅爾比即Amp-FLP,加之這些片段呈孟德爾或遺傳,因此用之作為連 鎖分析的標(biāo)記具有重要價值.目前Amp-FLP已廣泛應(yīng)用多種遺傳病的連鎖分析如DMD/B MD,DKU等.最近幾年的研究還發(fā)現(xiàn),已可是核苷酸重復(fù)的長度變異可導(dǎo)致許多人類疾 病.目前已證實的的與人類疾病有關(guān)的致病性重復(fù)之聯(lián)核苷酸有脆性×染色體綜合征 (CGG)>52,肌強直性營養(yǎng)不良DM(CTG)>50;×連鎖脊髓和延髓肌萎縮(CAG)HD(CAG)當(dāng). 利用串聯(lián)重復(fù)區(qū)所測序列合成的引物即可對這些遺傳病時行基因診斷. 三、PCR技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用 (一)PCR技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的地位 傳統(tǒng)的產(chǎn)前基因診斷主要依賴于以探針為基礎(chǔ)的Southernblotting及RFLP,以此 可診斷缺失型突變及個別的點突變.但由于其操作的復(fù)雜性及儀器設(shè)備的限制,耗時 長,準(zhǔn)確性不高,尚需同抗素標(biāo)記,因而大大的限制了它所的應(yīng)用.自從80年未PCR技 術(shù)而始應(yīng)用于產(chǎn)前基因診斷以來,隨著該技術(shù)的發(fā)展,愈來愈受到人們的重視和歡 迎,就目前來看,它已成為遺傳病產(chǎn)前基因診斷的最常用技術(shù).以此技術(shù)為基礎(chǔ)的各 種突變基因檢測方法已成為遺傳病基因診斷的主要手段. (二)PCR產(chǎn)前基因診斷的途徑 1.產(chǎn)前基因診斷胎兒標(biāo)本的來源 由于PCR技術(shù)本身的特點,即可不短時間內(nèi)將微量的DNA擴增數(shù)百萬倍,因此它適 應(yīng)于各種來源的DNA標(biāo)本. (1)羊水穿刺,在如15周后可經(jīng)母親脆壁穿刺獲羊水,其內(nèi)含有大量的胎兒脫細(xì) 胞5-10ml羊水即可獲得足夠量的PCR分析DNA樣品. (2)絨毛采樣,在如早期(9-12周)經(jīng)陰道在B超引導(dǎo)采取絨毛樣品,它含有豐富的 DNA. (3)胎兒血液采集:有簡條途徑:胎兒臍靜脈穿刺,胎兒鎖采集. (4)胎兒活檢:可用穿刺取樣,亦可經(jīng)胎兒鏡取樣.可在始17-19周進行 (5)母外周血分離胎兒細(xì)胞,目前已用于胎兒性別的預(yù)測. (6)宮頸刷取細(xì)胞. (7)著床前取細(xì)胞 2.DNA的抽提:不同組織來源有其不同的提取方法. 3.DNA的擴增及檢測 根據(jù)不同的突變及檢測目的采用不同的檢測方法,但需要注意的定防止1個染造 成的假陽性結(jié)果。目前利用PCR技術(shù)能進行產(chǎn)前診斷的遺傳病有多種,常常采用多種 方法聯(lián)合應(yīng)用,如連銀分析與突變點直接根態(tài)聯(lián)合應(yīng)用,PCR與Southern印跡雜交聯(lián) 合應(yīng)用高,以求最下限度的精確。 |
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