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          生物知識

          PCR技術(shù)應(yīng)用三:突變基因檢測

          作者:admin 來源:本站 發(fā)布時間: 2011-01-05 11:02  瀏覽次數(shù):
          購買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 m.kjhfd.cn

          基因突變(gene mutation)是遺傳病和腫瘤發(fā)生的根本原因,檢測與遺傳病及惡 性腫瘤發(fā)生有關(guān)的突變基因(mutant gene)是分子生物學(xué),醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)及腫瘤學(xué)研究 的熱點(diǎn),它對闡明遺傳病和腫瘤發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)及其診斷和早期診斷具有重要 \意義,分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,尤其是PCR技術(shù)的出現(xiàn)及近年來以PCR技術(shù)為基礎(chǔ), 結(jié)合傳統(tǒng)技術(shù)的突變基因分析方法為人們提供了許多快速、簡便、準(zhǔn)確的基因分析途 徑,并取得了令人矚目的成果.

            基因突變是癌基因激活,抗癌基因失活及遺傳病發(fā)生的根本原因,從廣義的角度 來看,基因突變包括點(diǎn)突變,染色體突變和基因組突變?nèi)N形式,只是它仍所涉及的 范圍不同,后兩種基因突變涉及的基因較多,可通過光學(xué)顯微鏡分析細(xì)胞有絲分裂中 期的染色體而檢出.亦可在間期用標(biāo)記探針檢出,點(diǎn)突變通常的涉及的范圍較少,它 是腫癌和遺傳病發(fā)生的主要分子改變,因此,它是基因分析的主要研究內(nèi)容.不同類 型的基因突變有不同的檢測途徑,大致方法包括:應(yīng)用基因探針直接檢測;應(yīng)用PCR 技術(shù)檢測;利用探針技術(shù)進(jìn)行分析。

          PCR在突變基因檢測時的應(yīng)用

            利用核酸探針及Southern印跡雜交技術(shù)進(jìn)行基因突變分析時由于諸多限制難以滿 足這際工作的需要,自從PCR技術(shù)問世以來,建立于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的突變基因檢測技 術(shù)發(fā)展迅速,它不僅能在短時間內(nèi)檢出發(fā)生突變的基因,而且即使獲得極微量的組織 亦可經(jīng)PCR擴(kuò)增而進(jìn)行中種檢測,加上PCR技術(shù)與探針雜交技術(shù),RFLP技術(shù)及PCR直接 測序的結(jié)合,改換方法得以迅速發(fā)展和推廣,大大的促進(jìn)了遺傳病及腫瘤有關(guān)的基因 的研究進(jìn)展.

          一、點(diǎn)突變的PCR直接檢出

          (一)用PCR直接檢測缺失:

            當(dāng)基因內(nèi)缺失時,可用已知的該基因DNA序列在缺失片段的兩側(cè)設(shè)計一對引物, 然后進(jìn)行PCR,對其產(chǎn)物行瓊糖凝膠電泳,溴乙錠染色,紫外檢測儀下檢測有無特異 性的擴(kuò)增產(chǎn)物,即可非常容易的判斷待檢稱本中有無DNA片段的缺失.

            1.一對引物PCR檢測缺失如果一個基因的DNA序列已經(jīng)清楚,其缺失部位亦較為固 定,即可根據(jù)缺失發(fā)生區(qū)域的DNA序列在缺失片段的兩側(cè)合成一對合適的引物進(jìn)行PCR, 然后瓊脂糖凝膠電泳及溴乙錠染色,短波紫外燈下觀察有無特異性的擴(kuò)增片段,該方 法是檢測基因片段缺失最為快速的方法,在實際應(yīng)用中,為了避光因某些原因引起的 擴(kuò)增失敗而導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn),常在反應(yīng)體系中加入一對與缺失片段無關(guān)的基因 引物,同時加以擴(kuò)增,以確定無特異性擴(kuò)增帶并非因反應(yīng)體系的原因的引起.如在應(yīng) 用PCR技術(shù)進(jìn)行X地貧Bartα基因胎兒水腫綜合征義基因缺失檢測時,常用一對引物擴(kuò) 增缺失區(qū)域,同時同一對β基因引物擴(kuò)增β基因的一個片段,然后電泳檢測.若同時 即有α和β基因的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,則說明α基因的擴(kuò)增產(chǎn)物則說明模板DNA中有α 基因的缺失,為Bart胎兒水腫綜合征.

            2.多對引物的多重PCR檢測缺失:對于某些遺傳病的致病基因來說,其缺失具有明顯的異質(zhì)性,即在不同患者其缺 失片段有所不同,因而難以用一對缺失部位的引物將所有的缺失檢出,在這種情況 下,我們可設(shè)計多對引物檢測該基因的不同外顯子區(qū)域,即用同一PCR體系擴(kuò)增多個 外顯子然后用瓊糖凝膠電泳檢測有無缺失的片段,若某一特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物帶缺如, 則可判定為該片段的缺失,該檢測方法是對已知結(jié)構(gòu)基因有無缺失片段的最快速可行 的檢測途徑,目前已用于多種遺傳病基因缺的檢測.如在DMD/BMD缺失型突變的檢測 中,用23對引物分為三組進(jìn)行多重PCR可改98%的缺失得以檢出,另外還有人用9對物 進(jìn)行兩組多重PCR,大約可檢出DMD/BMD92%的缺失型突變.

            3.用PCR技術(shù)進(jìn)行雜合性丟失的檢測:有報道,PCR技術(shù)尚可用于檢測雜合性丟失可采用PCR-SSCP及PCR定量技術(shù)進(jìn)行檢 測.

          (二)單個堿量置換的PCR直接檢出

            1.直接檢測限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的變化-PCR產(chǎn)物酶解分析

            PCR產(chǎn)物的酶解分析,主要用于檢測可引起酶切位點(diǎn)改變--包括所增加的酶切位 點(diǎn)及原有的酶切點(diǎn)消失的單堿是量置換性點(diǎn)突變.當(dāng)某一點(diǎn)突變引起DNA片段中酶切位 點(diǎn)發(fā)生改變時,則可用酶切位點(diǎn)兩側(cè)的引物擴(kuò)增一含該切點(diǎn)的DNA片段,然后用相應(yīng) 的內(nèi)切酶進(jìn)行處理,電泳檢測,與正常的無改變的段進(jìn)行對片分析即可確定有無酶切 位點(diǎn)的改變.比如狀細(xì)胞貧血的發(fā)生即是由一酶切位點(diǎn)的改變的改,正常情況下靶DNA 的擴(kuò)增產(chǎn)物為294bp,經(jīng)OxaNI消化后產(chǎn)生191bp和103bp二個片段,但鐮狀細(xì)胞貧血的 突變使該切點(diǎn)消失,OxaNI消化后仍為294bp的片段,而雜合子則是有294、191和103 三個片段。用引方法檢測突變快速可簡便,但必須在突變點(diǎn)涉及到限制性內(nèi)切酶切關(guān) 并引起進(jìn)次復(fù)時不能因此方法檢測,因此其應(yīng)用受到限制,反能檢出點(diǎn)突變的極少一 部分.

            2.3'特異PCR,擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)及等位特異PCR.

            以上三種方法結(jié)構(gòu)是基于以下機(jī)理,只是不同作者的采用的名河差別而異.

            在PCR擴(kuò)增時,引物的延伸是從其3'未端開始的,而這種延伸的進(jìn)行要求引物3'端 的堿基與模板需完全配對,只有這樣引物才能延伸,擴(kuò)增才得以進(jìn)行下去而得到預(yù)期 的擴(kuò)增產(chǎn)物,若引物3'端與模板不能配對,則引物的延伸即阻斷,不能得到相對應(yīng)的 擴(kuò)增產(chǎn)物,基于以上事實,可利用3'端含突變堿基的引物來檢測靶DNA中有無相應(yīng)的 突變位點(diǎn),此即3'特異PCR,擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)及等位特異PCR.該反應(yīng)系統(tǒng)包含兩個 PCR擴(kuò)增反應(yīng),有兩對引物但它們的3'端有差異,一為正常引物,另一為3'端編食突 變的引物,正常引物只與正常模板互解,PCR時擴(kuò)增相應(yīng)的產(chǎn)物,而食突變的引物只 與突變的模板附擴(kuò)增出相應(yīng)的產(chǎn)物.擴(kuò)增完成后可直接同瓊脂糖電泳技術(shù)檢測分析結(jié) 果。利用該系統(tǒng)進(jìn)行基因突變檢測時不僅能檢出突變的純合子,而且能檢出雜合子個 體,在這種情況下,同一個體的DNA模板利用突變引物和正常引物均能引發(fā)擴(kuò)增反應(yīng). 尚可利用多對突變引物和正常引物進(jìn)行多重3'-特異PCR,可攻DNA分子上的多位點(diǎn)變 化的鑒定準(zhǔn)確快速,簡便。

            3.PCR直接測序

            DNA序列分析是檢測基因突變最直接最可信的方法,它不僅可確定突變的部隊, 而且還可確定突變的性質(zhì).PCR直接測序是指對PCR產(chǎn)物進(jìn)行的直接序列分析,而不是 家傳的測序技術(shù)先將DNA待測片段克隆于測序載體上,這不僅大大的簡化了操用步 驟,節(jié)省大量的人力和物力,而且可實現(xiàn)自動化操用,加之新的熒光檢測技術(shù)的應(yīng) 用,使測序的效率大大提高.

            采用PCR循環(huán)直接測序時,應(yīng)首先將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為單鏈測序模板,目前常用的 轉(zhuǎn)化方法為不對稱PCR,即在反應(yīng)體系中引物濃度的差異來形成單鏈DNA,通常側(cè)引物 的濃度為100∶1.當(dāng)某一引物被耗盡后,另一引物擴(kuò)增的片段即為單鏈然后即可用于 測序,此外,獲得單鏈DNA還有磁珠俘獲法,外切酶消化法及Genomic amplification with transcript sequeucing法(簡稱GAWTS法).PCR直接測序的最新發(fā)展是將雙脫氧 絡(luò)子技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行循環(huán)測序,在PCR反應(yīng)體系中同時將ddNTP加入,并利 用同位素或熒光素標(biāo)記的引物引導(dǎo)擴(kuò)增后,得模板的擴(kuò)增與測序同時進(jìn)行,其特異在 于使用的模板量小且不需分離單鏈.

            應(yīng)用PCR測序有以下優(yōu)點(diǎn):

            (1)附模板的要求,模板需要量小.

            (2)方法簡便,操作易于標(biāo)準(zhǔn)化,自動化.

            (3)測序效率高,準(zhǔn)確,在短時間即可完成.

            4.PCR-寡核苷酸探針斑點(diǎn)雜交(PCR-ASb)

            如果一個基因的突變部位,性質(zhì)經(jīng)測序分析已經(jīng)闡明,即可用該方法直接檢測突 變.該方法的原理即利用人工合成的寡核苷酸片段(一般為19n+)作為探針,與經(jīng)PCR擴(kuò) 增獲得的靶DNA進(jìn)行雜交,在嚴(yán)格控制雜交條件的前提下,通過斑點(diǎn)雜交式其它類型 的雜交來檢測PCR產(chǎn)物中有無豐應(yīng)突變,即探針與靶DNA片段之間只要有一個堿基不相 互配對或錯記,就能檢出.

            (1)探針,探針一般合成兩個,一個為正常序列,另一含有突變位點(diǎn),前者與正 常靶DNA完全互解,后地只與突變DNA互補(bǔ),一般長充為19bt.該探針稱之為等位特異 寡核苷酸探針(allele specific oligo nucleotide probe,ASO探針).

            (2)雜交類型,PCR技術(shù)的出現(xiàn),從根本上解決了靶DNA的來源問題,使人們能在 很短的時間內(nèi)獲足夠量的靶DNA,傳統(tǒng)的PCR-ASO技術(shù)主要是將PCR,占物固定于雜交 膜上,然用不同的標(biāo)記探針檢測,亦有將已標(biāo)記好的探針預(yù)先固定于雜交膜上,再使 之與PCR產(chǎn)物結(jié)合,檢測有無完全互補(bǔ)的DNA產(chǎn)物.

            (3)探針的標(biāo)記,最先應(yīng)用的標(biāo)記物為放射性物質(zhì)有32P,34S,但由于其來源, 半衰期及放射性危害不能普遍應(yīng)用.PCR技術(shù)的引進(jìn)使可在短時間內(nèi)獲得足夠量的靶 DNA片段,因而對探針的要求亦有的降低,因非同位素標(biāo)記的探針亦可獲非常滿意的 結(jié)果,它不僅使ASO探針使用起來受加快是簡便,而且無同位素半衰期的限制,操作 亦受安全,適合于臨床應(yīng)用.目前已用PKU,β地貧雜的基因突變檢測.

          二、用PCR技術(shù)快速篩查突變基因

            前邊所述及的方法均可直接檢出突變部位,而其前提則是突變的性質(zhì)和部位必須 清楚,但在許多情況下,基因突變的位點(diǎn)不固定,而且性質(zhì)亦不是非常清楚,因此就 需要用一些快速簡便的篩查方法以確定檢材中有無基因突變,近年來,以PCR技術(shù)為 基礎(chǔ)建立起來的突變快速篩查技術(shù)已普遍應(yīng)用于腫癌及遺傳病基因突變的檢測.

          (一)PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-single-strand conformation polymorphism,SSCP)

            PCR-SSCP是近年來發(fā)展起來的一種分析突變基因的方法,由于該方法對檢測基因 的單個堿量置換和某一片段DNA突變位點(diǎn)的篩查提供了有效而快速的手段,現(xiàn)已廣泛 應(yīng)用于遺傳及惡性腫癌基因突變的分析.

            1.PCR-SSCP的原理

            PCR-SSCP于1989年首先報道,該方法的原理是基于序列不同的DNA單鏈片段,其 空間構(gòu)象亦有所不同,當(dāng)其在非變性聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳時,其泳的位置亦發(fā) 生變化而表現(xiàn)出不同序列單鏈其電泳遷頻率的差異,從而據(jù)引判斷有無突變存在.對 于一段DNA來說,其單鏈具有特定的空間構(gòu)象,這種空間構(gòu)象的形成與該段DNA的堿基 序列有關(guān),當(dāng)這段DNA發(fā)生突變,基堿基序列亦發(fā)生相應(yīng)的變化,空間相象亦隨之改 變,研究發(fā)現(xiàn),不同空間構(gòu)象的DNA單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠電泳時的遷效率有所 不同,這樣對于同一段單鏈DNA來說,這種空間構(gòu)象的變化及電泳遷移的改變即能說 明其有突變的發(fā)生因此,可用經(jīng)PCR擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)變性成單鏈然后在中性膠中電 泳,即可檢出有無突變.

            2.PCR-SSCP是檢測基因中點(diǎn)突變的一種快速而簡便的方法,可用于多個標(biāo)本的篩 查,應(yīng)用時應(yīng)注意以下問題.

            (1)敏感性:PCR-SSCP對小于300bp的DNA片段敏感性達(dá)90-99%,一般認(rèn)為隨著DNA 片段的增大,其敏感性亦相應(yīng)的降低,多數(shù)報道認(rèn)為的檢測的擴(kuò)增片段以100-200nt 最為敏感,但近來的報道發(fā)現(xiàn),175-345nt范圍內(nèi)進(jìn)行PCR-SSCP靈敏度無明顯變化, 亦有人用多重SSCP(multiple SSCP)500nt的單鏈DNA點(diǎn)突變亦可檢出.

            (2)膠的濃度與厚度,一般濃度為5-6%,需要強(qiáng)調(diào)的是丙烯酰胺與雙酰酰胺間的 比例一般為40∶1或70∶1.膠的厚度應(yīng)小于1mm.

            (3)甘油濃度:在室溫條件下,在凝膠中加入少量甘油(5%-10%)可獲滿意效果,在 突變應(yīng)用時應(yīng)根據(jù)實驗來確定,在其它條件都固定時,對比1%、5%、10%的甘油濃度 時的檢測效果,以找出最適應(yīng)甘油濃度.

            (4)電泳的濃度一般通過實驗來模索最佳溫度,一般以10-15℃效果較好.

            3.PCR-SSCP結(jié)果的顯示:傳統(tǒng)的PCR-SSCP電泳結(jié)果的顯示需要借助同位素標(biāo)記, 方法復(fù)雜,限帽了其推廣.近年來非同位素方法的發(fā)展得SSCP技術(shù)得以廣泛應(yīng)用,避 免了同痊素法清多不便,適合于臨床檢測的要求,非同位法有以下幾種:

            (1)非同位素標(biāo)記物摻入法:可同生物素或地高親標(biāo)記的三磷酸化脫氦核苷酸摻 入,然后因相應(yīng)的方法顯色,但該方法操作復(fù)雜,所需試劑故為昂貴是其缺點(diǎn).

            (2)SSCP銀染法,是一種簡便實用的方法經(jīng)濟(jì),快速,可在1-2小時完成,盡管其 靈敏度故同位素方法低,但可完全滿足檢測要求,該衛(wèi)開始逐漸取代同位素顯方法.

            (3)EB染色法,方法,但安全性差(EB為致癌劑),靈敏度低是其缺點(diǎn).

            (4)其它,尚有熒光法標(biāo)記SSCP高,雖然其高效,靈敏,自動化高,但因期需要 特殊設(shè)備,環(huán)以推廣.PCR-SSCP的出現(xiàn)及應(yīng)用,使人們對突變基因的檢測和篩查途徑 大為改觀,該方法膠的檢測出率堿置換點(diǎn)突變,而且標(biāo)本適用范圍廣,多種類型的突 變(如短核苷酸片段的括小與缺失,等均可檢出,而且還能應(yīng)RT-PCR-SSCP及mRNA-SS CP進(jìn)行分析,加上操作及技術(shù)條件易于掌握,還可適用大量標(biāo)本的篩查,因而有廣闊 的應(yīng)用前景,其缺點(diǎn)在于不能確定突變的部位和性質(zhì).

          (二),變性梯度膠(DGGE),恒定變性膠(CGGE)及溫度(TGGE)檢測基因突變.

            DGGE,CGGE及TGGE三種方法是基于相同的原理而設(shè)計的突變檢測方法,它仍均是 根據(jù)DNA的解鏈特性而設(shè)計.對于同一定序列組成或的DNA片段來說,它具有恒定的解 鏈溫度(Tm),但若其序列發(fā)生改變時,Tm值亦發(fā)生改變,在含有變性因素(變性劑, 高溫)的凝膠半進(jìn)行電泳,當(dāng)其比鏈解開形成分叉時,電泳遷移的速度就會改變.Tm值 全要取決于DNA的堿基組成,序列中出現(xiàn)單堿基替換時,Tm亦發(fā)生改變,電泳遷移率 亦改變,此即DGGE,CDGE及TGGE鑒定突變的技術(shù)基礎(chǔ).

            1.變性梯度凝膠電泳(denaturing gel gradient electrophoresis,DGGE)

            DGGE是檢測基因突變故為精確的方法,它不僅可檢測單一片段的單點(diǎn)突變,對多 點(diǎn)突變的檢測亦較容易,該方法與PCR技術(shù)相結(jié)合,使其能非常快速的對大量標(biāo)本進(jìn) 行分析.

            對于一DNA片段來說,其Tam值與基堿基組或有關(guān),當(dāng)其堿基組成發(fā)生變化時,Tm 值亦改變,因此,對于突變的片段來說,若其在一變性物質(zhì)線性梯度增加的凝膠上進(jìn) 行電泳時,隨著變性劑濃度的增加,當(dāng)這種濃度達(dá)一定值時突變的DNA片段發(fā)生解鏈 而形成分叉,其電泳遷移速度變慢.因此突變的DNA片段與正常的DNA片段電泳的遷移 位置有差別,研究證明DGGE可檢出任何糞型的單堿基取代,如果將突變型與正常的 DNA片段形成異源雙鏈時,其敏感性大大提高.

            2.恒定變性膠電泳(Constant deratarared gel electrophoresis CDGE)

            CDGE是DGGE基礎(chǔ)上發(fā)展起來的基因突變檢測技術(shù),亦是利用突變基因與正?;?片段間Tm值的差異來檢測突變的方法,該方法與DGGE的區(qū)別在于聚丙烯酰胺中的含的 變性劑濃度相當(dāng)于含突變基因片段的Tm值,而且濃度恒定,而不是線性遞增.為了提 高DGGE和CDGE的檢測敏感性,通常在一側(cè)引物的5'端設(shè)計一含GC的區(qū)域(GC-ClampGC 鉗),避免了DNA的完全解鏈,從而提高了突變的檢出率,可達(dá)100%.

            3.溫度梯度凝膠電泳(Temperature gradient gel electrophoresis TGGE)

            該方法是將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物量一中性聚丙烯酰胺凝膠上,在一溫度線性梯度上升 的電場中進(jìn)行電泳,當(dāng)DNA雙鏈到達(dá)其Tm時,雙鏈解開,形成分叉,而影響電泳遷移 率,突變的擴(kuò)增產(chǎn)物其Tm值與野先型有明顯不同,因而有不同的解鏈區(qū),從而造成電 泳遷移效率的差別,據(jù)此可判斷檢材中DNA有無突變.

          (六)異源雙鏈

            在同一擴(kuò)增體系中,若同時含有正常模板和突變型模板時,隨著PCR的循環(huán)進(jìn) 行,野生型基因片段和突變型片段均可擴(kuò)增,并形成了異循雙鏈,由于異源雙鏈中配 區(qū)的出現(xiàn),因而其它間構(gòu)型亦發(fā)生改變,這機(jī)型上的差別即形成電泳圖譜上的差異, 這種方法適合于較小DNA片段的分析,一般在300bp以下,其敏感性與SSCP相似,該技 術(shù)簡便,適用于快速的突變檢出,已用于多種遺傳病基因突變的研究.

            除上述的幾種以PCR為基礎(chǔ)的突變檢出技術(shù)外,還有錯配堿基化學(xué)裂解法,PCR- 產(chǎn)物的RNA酶檢出法及引物競爭法用于基因突變的檢出,尤其是錯配堿基化學(xué)裂解和 PCR-RNore裂解對突變的檢測仍是10前廣泛應(yīng)用的突變檢出技術(shù),化學(xué)裂解法以期敏 感性高,檢測片段長而應(yīng)用更為廣泛.

            總之,以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)建立的基因突變檢測技術(shù)有多種,而且各有其優(yōu)缺點(diǎn), 但目前較為廣泛應(yīng)用的為PCR-SSCP,PCR-ASO及PCR循環(huán)直接測序,隨著新方法的不斷 出現(xiàn),將會大大的促進(jìn)基因突變的研究.

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