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康寧/Corning® 淋巴細胞無血清培養(yǎng)基
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1、細胞（組織）培養(yǎng)年鑒 1878 Claude Bernard:證明一個器官的生理系統(tǒng)在個體死亡以后仍然可以人工維持。 1885 Wilhelm Roux:在一個生理溶液中維持一快雞胚的活性并觀察其發(fā)育，從而證實該發(fā)育與雞胚的其他部分無關(guān)。 1887 Ross Harrison:利用凝固的青蛙淋巴液作為培養(yǎng)基，在體外培養(yǎng)青蛙神經(jīng)嵴，維持其活性達數(shù)星期，并觀察到了神經(jīng)纖維的生長，從解決了神經(jīng)纖維的來源問題。Ross Harrison被人稱為細胞培養(yǎng)之父。 1910 Burrows:率先在血漿凝塊中長期培養(yǎng)雞胚細胞. 1911 Lewis & Lewis:由海水、血清、胚胎提取物和鹽和蛋白胨為原料配制成了第一個人工的細胞培養(yǎng)液，并觀察到了單層細胞的有限生長。 1916 Rous & Jones:開創(chuàng)使用胰酶來收獲貼壁生長的細胞。 1923-1931 Carrel & Baker:研制T型培養(yǎng)瓶大規(guī)模培養(yǎng)細胞。 1927 Carrel & Rivera:制造了第一個病毒疫苗：牛痘疫苗。 1933 Gey: 發(fā)明了轉(zhuǎn)管培養(yǎng)細胞的技術(shù)。 1948 Fisher: 研制成了第一個化學(xué)成分清楚的細胞培養(yǎng)液CMRL1006，該培養(yǎng)液至今還在使用。 1952 Gey 和同事：分離培養(yǎng)了Hela細胞。 1952 Dulbecco:發(fā)明了噬斑法，用長滿的單層細胞檢測病毒。 1954 Abercrombie: 觀察到了體外培養(yǎng)細胞接觸抑制的現(xiàn)象。 1961 Hatflick & Moorhead：顯示人成纖維細胞在一定的代數(shù)之后會死亡。 1965 Ham:配制了第一個無血清培養(yǎng)液。 1975 Kohler & Miltein:成功的得到了第一個用于單抗生產(chǎn)的雜交瘤細胞株。 2、怎樣查到一個特定細胞株的相關(guān)知識和培養(yǎng)條件？ ATCC (American Type Culture Collection) 收集了絕大多數(shù)常用細胞的詳細資料。 打開ATCC網(wǎng)頁的Cells and hybridomas鏈接，輸入細胞名稱就可以搜索ATCC的細胞數(shù)據(jù)庫。 數(shù)據(jù)庫中有每一種細胞的詳細描述，包括細胞的來源，培養(yǎng)和凍存條件，顯微形態(tài)以及相關(guān)文獻等資料。 3、為什么大多數(shù)細胞培養(yǎng)需要用二氧化碳培養(yǎng)箱? 一般細胞培養(yǎng)液的pH在7.0-7.4之間。由于碳酸鹽pH緩沖系統(tǒng)是一種生理pH緩沖系統(tǒng)（它是人體血液中最重要的pH緩沖系統(tǒng)），所以大多數(shù)培養(yǎng)液用它來保持穩(wěn)定的pH。用粉末配制培養(yǎng)液時，常常需要加入一定量的碳酸氫鈉。 對大多數(shù)以碳酸鹽作為pH緩沖系統(tǒng)的培養(yǎng)液而言，以為了維持穩(wěn)定的pH，培養(yǎng)箱中的二氧化碳需要維持在2-10%之間，以保持培養(yǎng)液中溶解的二氧化碳的濃度。同時細胞培養(yǎng)的器皿需要一定程度的透氣，以便于氣體的交換。 是不是采用其他pH緩沖系統(tǒng)就不需要二氧化碳培養(yǎng)箱了呢？人們發(fā)現(xiàn)由于空氣中的二氧化碳濃度很低，如果細胞不在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液中的HCO3-會被耗盡，這樣會影響細胞的正常生長。所以大部分動物細胞的培養(yǎng)，還是需要二氧化碳培養(yǎng)箱。 細胞培養(yǎng)液中常附加其他的pH緩沖系統(tǒng)，比如HEPES緩沖系統(tǒng)，來增加pH緩沖能力。HEPES在pH7.2-7.4之間有很強的緩沖能力，當(dāng)透氣的培養(yǎng)器皿被拿到二氧化碳培養(yǎng)箱外面的時候，由于空氣中二氧化碳濃度很低，培養(yǎng)液中碳酸鹽緩沖系統(tǒng)就會失去效果，這時候HEPES緩沖系統(tǒng)就能繼續(xù)保持pH的穩(wěn)定。 4、二氧化碳培養(yǎng)箱的挑選和使用 由于動物細胞培養(yǎng)液一般使用碳酸鹽pH緩沖系統(tǒng)，要求培養(yǎng)環(huán)境中維持一定濃度的CO2，所以動物細胞的培養(yǎng)一般需要CO2培養(yǎng)箱。 CO2培養(yǎng)箱采用兩種不同的CO2維持系統(tǒng)。一種方式是通過使用空氣泵，將CO2和空氣按一定比例混合后吹入培養(yǎng)箱。另一種方式是通過一個自動的CO2檢測控制系統(tǒng)，在檢測到CO2濃度低于要求濃度時打開CO2氣閥充入CO2。由于前一種方法耗費CO2而且不容易精確控制CO2濃度，先進的CO2培養(yǎng)箱都采用自動監(jiān)控系統(tǒng)來維持CO2的濃度。 配有自動CO2檢測控制系統(tǒng)的培養(yǎng)箱需要根據(jù)生產(chǎn)廠家的說明，定期做CO2濃度的測試和矯正，防止因為零點漂移而導(dǎo)致CO2顯示濃度和實際濃度不一致。 CO2培養(yǎng)箱的隔熱采用水套式和氣套式兩種類型。水套式需要用戶在安裝培養(yǎng)箱時培養(yǎng)箱壁的空間內(nèi)灌入大量蒸餾水。由于水的比熱容很高，水套式的優(yōu)點是有助于均勻散熱和避免形成冷區(qū)，以及在斷電后能夠比較好的減緩培養(yǎng)箱內(nèi)溫度的降低。它的缺點是由于灌入大量的水，培養(yǎng)箱變得非常沉重，不易搬動。有效的隔熱系統(tǒng)和先進的表面散熱元件的使用使氣套式培養(yǎng)箱兼?zhèn)淞溯p便性和水套式培養(yǎng)箱的優(yōu)點，所以新型的CO2培養(yǎng)箱大多采用氣套式。 目前大多數(shù)實驗室都使用進口的細胞培養(yǎng)箱。雖然進口的產(chǎn)品質(zhì)量上比較有保障，但價格很貴，而且售后服務(wù)不是很方便。國內(nèi)的細胞培養(yǎng)箱的質(zhì)量也有了很大的提高，價格低，售后服務(wù)也比較方便（筆者目前使用的二氧化碳培養(yǎng)箱是長沙長錦科技的，質(zhì)量和售后服務(wù)都不錯）。 CO2培養(yǎng)箱一般配一個水盤，用以維持很高的濕度。水盤內(nèi)的水要定期添加，水盤也要定期清洗以避免微生物的生長。 為了減少微生物的污染，有一些CO2培養(yǎng)箱提供滅菌功能。有的可以加熱到比較高的溫度來滅菌，有的則通過讓空氣循環(huán)通過一個紫外線腔體的辦法來滅菌，這樣就滅菌時就不需要中斷細胞的培養(yǎng)。 5、超凈臺的挑選和使用 為了避免污染，一般的細胞培養(yǎng)需要在超凈臺上進行。用于細胞培養(yǎng)的超凈臺的潔凈度一般為100級，即每立方英尺中大于0.5um的顆粒數(shù)量少于100顆，與計算機硬盤的生產(chǎn)環(huán)境要求相當(dāng)。 在超凈臺內(nèi)，過濾后的空氣垂直由上到下，或水平由內(nèi)到外穩(wěn)定的流動，從而維持一個潔凈的操作環(huán)境。根據(jù)氣流的方向，超凈臺可分為垂直式層流和水平式層流兩種類型。 在水平式層流型超凈臺內(nèi)，過濾后的空氣由內(nèi)到外流動，在操作過程中比垂直式層流型更容易維持一個潔凈的環(huán)境，減少污染的機會。但是由于氣流吹向?qū)嶒灢僮髡?，增加了實驗操作者感染病原體的機會，所以大部分實驗室都采用垂直式層流型的超凈臺。 在普通的垂直式層流型的超凈臺內(nèi)，過濾后的空氣自上往下流動，通過操作面板前后兩排開孔直接排出。這樣的超凈臺比較便宜，但是不適合病原體相關(guān)的實驗操作。相關(guān)病原體的操作必須要在生物安全柜內(nèi)進行。在生物安全柜內(nèi)，自上而下的過濾后的空氣經(jīng)過超凈臺，然后再次過濾后，才被排到外面，從而大大減少了病原體擴散的機會。當(dāng)然生物安全柜比較貴，但考慮到培養(yǎng)的細胞中以及血清中都有可能有病毒等病原體的存在，有條件的實驗室應(yīng)該盡量使用生物安全柜來進行細胞培養(yǎng)。 超凈臺需要定期檢查，超凈臺的空氣過濾系統(tǒng)也需要定期更換，以保證超凈臺內(nèi)的潔凈度?？諝膺^濾系統(tǒng)的更換次數(shù)可以詢問生產(chǎn)廠家。如果有潔凈度檢測設(shè)備的話，可以非常迅速的檢驗超凈臺的潔凈度。如果懷疑細胞培養(yǎng)過程中的污染是由于超凈臺內(nèi)潔凈度降低引起的，可以用將一個含微生物培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿在超凈臺內(nèi)敞口放置一段時間，然后在37℃培養(yǎng)的方法來評估。 超凈臺內(nèi)一般都有紫外線燈用于滅菌。紫外線燈的正確使用方法是在超凈臺使用前打開半小時左右。有的操作人員在不使用超凈臺的時候把紫外線燈一直打開，這樣不但沒有必要，而且會大大縮短紫外線燈的使用壽命。紫外線燈要根據(jù)生產(chǎn)廠家的說明定期更換。 超凈臺使用完之后要先用蒸餾水擦拭，然后再用70%酒精擦拭。直接用70%酒精擦拭濺在臺面上的培養(yǎng)液會在不銹鋼臺面上留下難以去除的污漬。 6、為什么培養(yǎng)的細胞要及時傳代？ 體外培養(yǎng)的細胞大多具有生長接觸抑制的特性，也就是說當(dāng)一個細胞被其他細胞包圍的時候，它就會停止生長。當(dāng)細胞鋪滿培養(yǎng)器皿的表面時，正常的細胞停止生長，但是轉(zhuǎn)化（即發(fā)生遺傳物質(zhì)突變）的對接觸抑制不敏感的細胞會繼續(xù)生長。如果不及時傳代，這些轉(zhuǎn)化的細胞就會逐步取代正常的細胞。 7、細胞培養(yǎng)中流行的錯誤（過時）知識 （1）血清一定需要加熱滅活 人們通常通過在56°C加熱30分鐘的辦法，來滅活血清中的補體，以及其中可能的微生物（比如支原體）的污染。加熱滅活帶來的問題是，血清中的氨基酸、維生素和生長因子等也會不同程度的被破壞。 Triglia and Linscott 的研究發(fā)現(xiàn)（1），胎牛血清中的補體含量很低，即使在未稀釋的胎牛血清中，也觀察不到溶血現(xiàn)象。另外37°C的加熱能夠有效滅活補體。所以對胎牛血清而言，并不需要通過專門的熱滅活來滅活其中的補體。 早期的血清制備中的濾膜的孔徑大于0.22um，不能有效的去除支原體的污染。熱滅活可以去除支原體的污染。但是現(xiàn)在血清制備中的終端濾膜的孔徑為0.1um甚至小到0.04um，所以血清中一般沒有支原體的污染。 綜合上面的觀點，除非有特別的情況，標(biāo)準(zhǔn)廠家生產(chǎn)的胎牛血清一般不需要加熱滅活。 需要說明的是，有些廠家生產(chǎn)的胎牛血清質(zhì)量并不符合標(biāo)準(zhǔn)。所以如果您的胎牛血清來自一家可信度不高的廠家，那么為了安全起見，還是以加熱滅活為好。 （2）培養(yǎng)液中一定要加抗生素 隨著超凈臺技術(shù)的提高，和超凈臺在細胞培養(yǎng)中的廣泛使用，在細胞培養(yǎng)過程中如果操作規(guī)范，引進污染的機會并不大。同時抗生素的使用大大增加了支原體等微生物污染的機會，所以普通的細胞培養(yǎng)，最好不要加抗生素。 （3）細胞培養(yǎng)室要異常的潔凈 由于以前超凈臺技術(shù)比較差，在超凈臺開啟的時候，外面的灰塵可能飄到超凈臺里，筆者曾經(jīng)見過的一個老式的沒有空氣過濾裝置超凈臺，僅使用紫外線燈滅菌，這樣實驗室的清潔就顯得很重要。現(xiàn)代的超凈臺從原理上來說，超凈臺外的污染源是很難到達超凈臺里面的(見文章5：超凈臺的挑選和使用)。所以保持細胞培養(yǎng)室一定程度的清潔固然有助于減少污染的機會，但是過度的清潔，比如用0.2%新潔爾滅拖地板，或者在培養(yǎng)室內(nèi)加紫外線燈消毒，并不需要，更重要的是實驗操作的規(guī)范。筆者曾經(jīng)工作過的一個細胞培養(yǎng)室，維護實驗室清潔的工作就是每天拖一次地板，每天大家進出并不換鞋換衣服，在2年多的時間內(nèi)從沒有發(fā)生過任何污染。 （4）在超凈臺上使用酒精燈 事實上使用酒精燈會造成空氣對流，從而帶起超凈臺面上的灰塵，反而增加污染的機會。更何況還增加了火災(zāi)的隱患。 [1]Triglia, R.P., Linscott, W.D. 1980. Titers of nine complement components, conglutinin and C3b inactivator in adult and fetal bovine sera. Molecular Immunology. 17:741-748. 8、一次性細胞培養(yǎng)皿等標(biāo)明 “Tissue Culture Treated”是什么意思？ 大部分動物細胞需要貼附在一個固相界面上才能生長。而一般只有親水的固相界面，細胞才能貼附。 最早的細胞培養(yǎng)器皿是由玻璃制作的。由于玻璃的表面是親水的，不經(jīng)過特殊的處理，普通的細胞就可以貼附生長。 聚苯乙烯透光性能好，具有較好的強度和易塑性，并且沒有毒性，成為一次性細胞培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等一次性細胞培養(yǎng)耗材的首選材料（一般的磁帶和CD盒也是用聚苯乙烯制成的）。然而聚苯乙烯表面是憎水的，所以需要經(jīng)過表面的改性處理，變成親水后才能適用于細胞培養(yǎng)。 一次性細胞培養(yǎng)皿等標(biāo)明“Tissue culture treated”，是表示該器皿經(jīng)過表面的改性處理，適合貼壁細胞的培養(yǎng)。而懸浮生長的細胞，就不一定需要這樣經(jīng)過特殊處理過的器皿。 但經(jīng)過表面的改性處理后的細胞培養(yǎng)皿等一般也適合懸浮細胞的培養(yǎng)。 9、細胞培養(yǎng)中邊緣效應(yīng)和解決辦法 在使用多孔板的細胞培養(yǎng)中，周邊孔的細胞生長情況和實驗數(shù)據(jù)常常和其他孔有系統(tǒng)誤差，這種現(xiàn)象統(tǒng)稱為邊緣效應(yīng)。在很多大規(guī)模藥物篩選實驗中，人們甚至棄去周圍孔，不用于實驗。 引起邊緣效應(yīng)的原因有多種，其中最常見的也容易明白的是周邊孔水份揮發(fā)比其他孔多而導(dǎo)致的系統(tǒng)誤差，這在四個角上的孔中尤其明顯。對于這個問題目前沒有根本的解決辦法。不過可以采用少開培養(yǎng)箱從而保持培養(yǎng)箱中的濕度等辦法來減輕。 另外一個不容易解釋的邊緣效應(yīng)是，在周邊孔中的細胞會集中在孔的外側(cè)，如下圖所示（孔內(nèi)白亮的為細胞集中的區(qū)域）。這種現(xiàn)象在實驗中常用的96孔板中十分明顯。由于大多細胞的生長會受周圍接觸細胞的抑制，所以這種邊緣效應(yīng)導(dǎo)致邊緣孔內(nèi)細胞平均生長速度要比其他孔來得慢，從而在實驗過程中引入系統(tǒng)誤差。這種邊緣效應(yīng)是由于在室溫下的培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移到37℃培養(yǎng)箱后，培養(yǎng)板上產(chǎn)生的溫度差影響細胞沉降引起的。所以這種解決邊緣效應(yīng)的一個簡單有效的方法，就是在培養(yǎng)板內(nèi)分入細胞后，在室溫下放置1-2個小時，讓細胞在沒有溫度差的情況下沉降并貼附，然后再轉(zhuǎn)移到37℃培養(yǎng)箱內(nèi)[1]。該方法至少適合CHO等在室溫下能貼壁的細胞。 [1]BETINA KERSTIN LUNDHOLT, KURT M. SCUDDER, and LEN PAGLIARO, A Simple Technique for Reducing Edge Effect in Cell-Based Assays. Journal of Biomolecular Screening 2003:566-570 10、細胞培養(yǎng)液簡介 雖然細胞培養(yǎng)的實驗早在19世紀(jì)末就開始了，但用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)液主要是動物的血清或淋巴液。被人稱為細胞培養(yǎng)之父的Ross Harrison就是利用青蛙的淋巴液來培養(yǎng)神經(jīng)細胞的。這樣的培養(yǎng)液不但性質(zhì)不穩(wěn)定，而且只能進行非常小規(guī)模的細胞培養(yǎng)。 第一個人工配制的培養(yǎng)液是由Lewis & Lewis在1911年由海水、血清、胚胎提取物和鹽和蛋白胨為原料配制成的。但是人們對于培養(yǎng)液中的化學(xué)成分并不清楚。直到1948年，F(xiàn)isher才研制成了第一個化學(xué)成分清楚的細胞培養(yǎng)液CMRL1006。 實驗室常用的細胞培養(yǎng)液的主要成分是氨基酸、葡萄糖、無機鹽、維生素和微量元素等。為了維持穩(wěn)定的pH，培養(yǎng)液中一般有一個pH緩沖系統(tǒng)，同時常加入少量的酚紅作為pH指示劑。另外培養(yǎng)液中一般需要加入一定量的血清。 培養(yǎng)液中的氨基酸除了13種細胞生長所必須的氨基酸外，往往加入一些非必需的氨基酸以促進細胞的生長。在必需的氨基酸中，L-谷氨酰胺在溶液中不穩(wěn)定（在4℃培養(yǎng)溶液中半衰期為3個星期，37℃中為1個星期），需要在使用時加入。 葡萄糖在培養(yǎng)液中的含量一般為1g/L（低糖）或4.5g/L（高糖）。它是細胞代謝重要的能量來源。 細胞培養(yǎng)液中都有一個平衡鹽系統(tǒng)，用于維持細胞的滲透壓、維持pH和細胞正常的代謝等。最常用的平衡鹽系統(tǒng)有Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS); Earle's balanced salts (EBSS) 和 Hanks' balanced salts (HBSS)。它們都含有細胞所必需的5種離子：鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子和磷酸根。培養(yǎng)液中的pH緩沖系統(tǒng)一般是碳酸氫鈉和HEPES等。 培養(yǎng)液中的維生素包括葉酸、維生素B、煙酰胺和吡哆醇等。培養(yǎng)液中的微量元素元素包括Cu2+ ，Zn2+ ，和Mn2+等。 血清中含有生長因子、促進細胞帖壁的因子、礦物質(zhì)、激素、脂類等，另外血清可以抑制胰酶的活性。 一般培養(yǎng)液都含酚紅作為pH指示劑，它是細胞培養(yǎng)液狀態(tài)的一個很好的標(biāo)志。過長時間的培養(yǎng)或者微生物的污染都會使培養(yǎng)液的pH發(fā)生改變。需要注意的是，酚紅可以模擬類固醇激素（尤其是雌性激素）的作用，所以如果培養(yǎng)的細胞對雌性激素敏感（比如實驗本身就是研究雌性激素對細胞的作用），就應(yīng)當(dāng)使用沒有酚紅的培養(yǎng)液。 11、選用血清時要注意什么？ 細胞培養(yǎng)使用的一般是胎牛血清。由于胎牛血清價格非常貴，為了節(jié)約，對于一些比較容易生長的細胞，有時候也使用新生牛血清，或者馬血清。 血清中含有血清清蛋白、生長因子等。對于大多數(shù)培養(yǎng)的動物細胞而言，培養(yǎng)液中加入血清是生長必須的。雖然無血清培養(yǎng)液已經(jīng)出現(xiàn)，但無血清培養(yǎng)液只適用于特定的細胞，而且價格一般比較昂貴，所以在比較長的時間內(nèi)，細胞培養(yǎng)仍然需要血清。 對于一種特定的細胞，可以從ATCC（American Type Culture Collection）查到培養(yǎng)液中需要加入的血清的種類和濃度。 來自不同商家的血清差異很大，即使來自同一商家的血清，不同批次之間仍然會有非常大的差異。對于培養(yǎng)不易生長的細胞而言，挑選優(yōu)質(zhì)的血清非常重要。一般來說，可以向血清生產(chǎn)商家索取少量不同批次的血清，經(jīng)過試驗后找到對細胞生長最有利的批次，然后大量購買該批次的血清，儲存于-80度的冰箱內(nèi)，供長期使用。 12、細胞培養(yǎng)過程中有哪些污染？ 細胞培養(yǎng)中的污染分為兩類，化學(xué)污染和生物污染。 化學(xué)污染 化學(xué)污染是一些對細胞有毒性的或?qū)毎a(chǎn)生刺激的化學(xué)物質(zhì)。這些污染一般來自于沒有洗凈的器皿、不純的化學(xué)試劑和質(zhì)量較差的蒸餾水等。 化學(xué)污染中比較引人注意的是細菌內(nèi)毒素。它是革蘭氏陰性細菌細胞死亡后解體釋放出的疏水性的細胞壁組成物質(zhì)，對塑料等疏水性強的物質(zhì)有很強的吸附能力。細菌內(nèi)毒素可刺激部分細胞產(chǎn)生一些激素或細胞因子，對細胞生長和實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。細菌內(nèi)毒素是臨床上的最主要的熱原（即注射到動物體內(nèi)會導(dǎo)致動物發(fā)熱），所以通過細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的疫苗、細胞因子等用在臨床上的藥品的生產(chǎn)過程中更是要避免細菌內(nèi)毒素的污染。 生物污染 生物污染包括比較容易發(fā)現(xiàn)的細菌、霉菌和酵母的污染，和較難發(fā)現(xiàn)的病毒、支原體和其他細胞的污染。 細菌、霉菌和酵母到處存在，它們能在合適的環(huán)境中非常快速的生長。這些污染比較容易觀察到，它們往往會使其污染的培養(yǎng)液產(chǎn)生可見的變化，或者通過顯微鏡觀察就可以看見。 由于病毒有種屬特異性，所以病毒污染的概率比較小。但是病毒污染難于發(fā)現(xiàn)，因為病毒顆粒特別微小，一般的實驗室都沒能力檢查細胞培養(yǎng)中污染的病毒。由于病毒一般潛伏在細胞內(nèi)，對整個細胞培養(yǎng)不是致死的，所以它可能會使研究人員長期得到受病毒影響的細胞的實驗結(jié)果。 1956 年 Robinson 及其同事首次發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)中的支原體污染。90年代初的一個調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在美國培養(yǎng)的細胞中，至少有15%被支原體污染 。由于支原體沒有細胞壁，在細胞培養(yǎng)液中幾乎是透明的，同時對常用于細胞培養(yǎng)中的抗生素不敏感，不引起 pH 變化，不使培養(yǎng)液渾濁，所以支原體污染不容易被發(fā)現(xiàn)，但是其存在會影響實驗的結(jié)果。 培養(yǎng)多種細胞時操作不當(dāng)，會導(dǎo)致細胞的交叉污染。由于不同細胞的生產(chǎn)速率不同，污染的生長速率快的細胞最終會完全取代被污染的細胞。 13、怎么樣才能減少污染的機會？ 減少化學(xué)污染 對于自己用粉末配制培養(yǎng)液的實驗室來說，配制培養(yǎng)液要使用重蒸餾水，以減少帶入化學(xué)污染的機會。如果要添加NaHCO3，要選用純度高的NaHCO3，最好是經(jīng)過細胞培養(yǎng)測試的。 另外盡量使用一次性的細胞培養(yǎng)器皿。由于標(biāo)準(zhǔn)廠家一次性細胞培養(yǎng)器皿的生產(chǎn)環(huán)境比較嚴(yán)格，得到的產(chǎn)品潔凈度很高，從而減少了由細胞培養(yǎng)器皿帶入污染的機會。 減少生物污染 由于一般的污染發(fā)生在細胞培養(yǎng)的操作過程中，所以良好的細胞培養(yǎng)操作環(huán)境和操作習(xí)慣是減少生物污染的關(guān)鍵。 要用一個專門的房間用于細胞培養(yǎng)，注意保持房間的清潔。 要有一個定期檢驗的合格的超凈臺（超凈臺內(nèi)的潔凈度應(yīng)該為100級，與計算機硬盤的生產(chǎn)環(huán)境相當(dāng)）。在使用超凈臺前開啟通風(fēng)裝置并打開紫外燈滅菌30分鐘。操作時要戴一次性橡膠手套，并噴灑70%酒精消毒。任何帶入超凈臺的非無菌物件都要噴灑70%酒精消毒。收集廢培養(yǎng)液的瓶子要加入漂白粉或漂白液，以避免微生物的生長。每次實驗完后，要向通向廢培養(yǎng)液瓶的塑料管內(nèi)噴灑70%酒精，并且用蒸餾水和70%酒精先后擦拭臺面（只用70%酒精擦拭會導(dǎo)致灑落在臺面的培養(yǎng)液在臺面上形成難以清除的污垢）。 不要在超凈臺里使用酒精燈等燈具，因為這樣會因燈的熱的火焰引起的空氣對流而破壞超凈臺里本來規(guī)則的空氣層流，使本來存在于超凈臺底層的微粒被帶到上層，帶來更多的污染機會。
加熱培養(yǎng)液的37°C恒溫水浴中非常容易有微生物的生長，從而成為一個重要的污染源。所以需要定期清洗恒溫水浴。 細胞培養(yǎng)箱內(nèi)的用于保持濕度的水盤也需要定期清洗。 為了減少不同細胞株間的相互污染，不要用同一瓶培養(yǎng)液或胰酶培養(yǎng)不同的細胞；不要在一個超凈臺上同時進行多種細胞的操作。 分裝每次小量使用的溶液（如胰酶、抗生素、谷氨酸溶液），以減少多次使用時污染的機會。 以防萬一 即使再小心，污染難免還是會發(fā)生。所以得到一個新的細胞株后的第一件事情，是把細胞生長擴增后凍存起來，以備不測。 何況一般的細胞在傳代次數(shù)多了以后，遺傳特性也會發(fā)生改變。通過批量凍存的辦法，可以有效的把培養(yǎng)的細胞控制在一定的代數(shù)以內(nèi)。 14、內(nèi)毒素是什么？ 內(nèi)毒素的化學(xué)成分是脂多糖，是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要組分之一。一個活的細菌很少釋放內(nèi)毒素，但死后可放出大量內(nèi)毒素。 內(nèi)毒素在血液中存在時會引起動物發(fā)熱，是醫(yī)療注射液中最主要的熱原。19 世紀(jì) 40 年代開始用注射溶液引起兔的發(fā)熱反應(yīng)實驗來檢測熱原（主要是細菌內(nèi)毒素）。 后來研究者發(fā)現(xiàn)鱟（一種海洋生物）血液遇到極微量的內(nèi)毒素會發(fā)生凝血反應(yīng)，從而在19 世紀(jì) 70 年代發(fā)明了鱟試劑用于快速精確檢測內(nèi)毒素。內(nèi)毒素含量一般用國際單位（ EU ）來衡量，一般來說 1EU 大致等于 0.1-0.2ng。 由于內(nèi)毒素會對很多種細胞產(chǎn)生刺激，影響實驗結(jié)果，所以在實驗中要盡量減少在培養(yǎng)液中的內(nèi)毒素的來源。 由于生產(chǎn)工藝的提高，來自標(biāo)準(zhǔn)廠家的血清和培養(yǎng)液中的內(nèi)毒素含量很少。所以現(xiàn)代實驗室細胞培養(yǎng)中內(nèi)毒素的來源主要是水、添加劑、細胞培養(yǎng)器皿等。傳統(tǒng)的玻璃儀器制備的雙蒸水和通過離子交換柱、活性炭柱和超濾三個環(huán)節(jié)的純水制備儀制備的超純水都能滿足細胞培養(yǎng)用水的要求。盛水器具上的細菌內(nèi)毒素可能給超純水帶來污染。長時間放置的超純水也可因盛水器具上細菌生長而污染細菌內(nèi)毒素。 內(nèi)毒素能緊密的粘在玻璃器皿上，實驗室里用普通的方法不能完全的消除除內(nèi)毒素。用 250 ℃， 30 分鐘或 180 ℃， 2 小時干熱滅菌能完全除掉玻璃器皿上的內(nèi)毒素。 一次性塑料器皿經(jīng)過高溫注塑成型，沒有內(nèi)毒素存在。但在處理、包裝等生產(chǎn)過程中，可能污染內(nèi)毒素。杭州生友生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的一次性細胞培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等在萬級無塵車間生產(chǎn)和包裝，產(chǎn)品的內(nèi)毒素含量低于 0.5EU/ml。 15、細胞的凍存 一個實驗室得到一個新的細胞株后，首先要把該細胞株培養(yǎng)擴增后凍存起來。細胞凍存首先可以在由于污染等情況丟失細胞時有備份可用，另外幾乎所有細胞在培養(yǎng)傳代的過程中發(fā)生一定程度的變異，為了保持實驗結(jié)果的一致，一般細胞在培養(yǎng)幾十代以后就不能再使用了，需要將凍存的，傳代較少的細胞化凍培養(yǎng)再使用。 細胞冷凍過程有四個要點：細胞的收獲、保護劑的使用、冷凍速率和儲存環(huán)境。 細胞的收獲 用來凍存的細胞一般選擇在細胞約鋪滿 90% 的時候，這時細胞生長狀態(tài)好，細胞數(shù)量也多，并且在收獲細胞前 24 小時換一次培養(yǎng)液。收獲用來凍存的細胞開始時方法和平時一樣，用 100xg 離心 5 分鐘收集細胞再重懸，活細胞記數(shù)。稀釋或濃縮到細胞保存的最終細胞濃度的二倍（一般是 400-1000 萬 細胞 /ml ），加入已經(jīng)配好的等體積的培養(yǎng)液保護劑混合溶液中輕輕混勻，分裝到凍存管，冷凍保存。 保護劑的使用 細胞凍存中， 一般使用DMSO 作為保護劑。在細胞凍存中， DMSO 使用的最終濃度一般是 5-15% ，某種具體細胞的凍存液中的DMSO濃度可以從ATCC查到。對特別敏感的細胞特別是雜交瘤細胞在凍存時使用 95% 血清和 5%DMSO 可能會好些。保護劑在使用時先用培養(yǎng)液或血清配成最終濃度的 2 倍，再與等體積的懸浮細胞的培養(yǎng)液混合。 細胞凍存的速率 細胞的冷凍速率最是控制在讓細胞有足夠的時間脫水而又不被過度脫水導(dǎo)細胞損害。對大多數(shù)細胞來說，每分鐘降 1 至 3 ℃是合適的。通常的操作是把細胞先在-20℃1-2個小時，再放入 -80℃冰箱過夜（如果沒有-80℃冰箱，可以用干冰替代），再轉(zhuǎn)入液氮罐或低于 -130℃的冰箱長期保存。 另外一個辦法是，在-20℃1-2個小時以后，把冷凍管懸掉在液氮罐的氣相中，以控制冷卻的速率。這個方法比較簡單，因為細胞也可以在液氮罐的氣態(tài)中長期保留，所以不用計時。對于沒有-80℃冰箱，或者購買干冰不方便的人來說，這是一個比較好的辦法。 儲存環(huán)境 細胞長期保存溫度是 -130 ℃或更低。液氮罐中氣態(tài)層溫度在 -140℃至 -180℃之間，細胞可保存在氣態(tài)層或浸入液氮中，如果可能最好保存在氣態(tài)層，因為這樣可避免由于有液氮進入凍存管而在拿出細胞時引起爆炸（但是這樣液氮罐內(nèi)只能存儲少量液氮，需要經(jīng)常添加）。細胞也可以在-80℃冰箱保存幾個月左右的時間。 16、怎樣化凍動物細胞？ 化凍過程的原則是要讓凍存的細胞快速融化。 如果細胞儲存在液氮液面下，使用者最好準(zhǔn)備好必要的防護器具（至少要戴上護目鏡，最好戴上面罩和較厚的手套），防止進入凍存管的液氮驟然膨脹引起爆炸而造成傷害(筆者曾經(jīng)在化凍的時候，為了防止污染，把冷凍管放到一個15ml離心管中，而且把蓋子擰上了，打算放到 37℃水浴，恰好回過頭去和別人談話，忽然聽到一聲爆炸聲，回頭一看，15ml的離心管就剩下蓋子了，其他的都爆飛了)。從冰箱或液氮罐取出細胞后將凍存管放 37℃水浴輕輕晃動使之化凍完全，注意不要讓水浸到蓋子以防污染發(fā)生。 由于大多防凍劑與細胞長時間接觸時對細胞有毒害，所以最好盡快除去細胞凍存時加入的防凍劑。 防凍劑的去除方式和細胞的敏感性有關(guān)。有些細胞在某些防凍劑存在的條件下能很好的貼壁生長，可以直接將化凍的凍存細胞連同其凍存液加入預(yù)備好 15-20ml 培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后換培養(yǎng)液。 對于敏感細胞要加入 10ml 培養(yǎng)液中， 100xg 離心 5 分，去上清后加培養(yǎng)液輕輕重懸細胞，加入培養(yǎng)器皿后在培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第二天更換培養(yǎng)液。 |
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