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抗生素治療導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)毒素釋放的研究進(jìn)展
中華外科雜志 1998年第0期第36卷 綜述
作者：李晉 彭毅志 肖光夏 吳其林
單位：610083 成都，成都軍區(qū)總醫(yī)院燒傷科(李晉、吳其林)；重慶第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院燒傷研究所(彭毅志、肖光夏)
由革藍(lán)陰性(Gˉ）細(xì)菌引起的各種感染仍是目前臨床上主要的并發(fā)癥和死亡原因之一。即使在應(yīng)用各種廣譜、高效抗生素治療感染取得巨大進(jìn)步的今天，對抗菌治療中產(chǎn)生的一系列嚴(yán)重反應(yīng)，如發(fā)熱、中毒性休克及多器官功能衰竭（MOF）等，仍然沒有取得防治的根本性進(jìn)展。其中抗生素治療中導(dǎo)致G細(xì)菌釋放內(nèi)毒素（lipoplysaccharide，LPS），以及由其引起的嚴(yán)重?fù)p害存在著十分復(fù)雜的作用機(jī)理沒有完全闡明，是一個主要原因［1］。梅毒患者用汞劑治療后可出現(xiàn)發(fā)熱等癥狀加劇的反應(yīng)，稱為雅-赫二氏反應(yīng)（Jarish-Herxheimer raction）。自五十年代以來，在抗生素治療的患者中，因Gˉ細(xì)菌裂解釋放出大量LPS造成臨床癥狀惡化的證據(jù)，先后在布魯氏菌、腦膜炎雙球菌和Gˉ細(xì)菌腸膿毒癥的患者中得到證實。自那以后，大量的實驗證實，抗生素治療中可以引起Gˉ細(xì)菌LPS釋放，作用于單核巨噬細(xì)胞介導(dǎo)多種炎癥因子釋放，如：TNF-α、白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6、IL-8、前列腺素、凝血素、干擾素、血小板基激活因子等。這些因子適量時可激活免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生殺滅微生物的有益作用。過量時可引起機(jī)體嚴(yán)重病理生理反應(yīng)，表現(xiàn)為發(fā)熱、低血壓、心動過速、休克、MOF及死亡［6，7］。醫(yī)學(xué)抗生素分冊，1996,17：192-195.
一、LPS及其作用原理
1．LPS結(jié)構(gòu)特點：LPS為Gˉ細(xì)菌外膜中的脂多糖成分。它由三部分組成：（1）O-特異性側(cè)鏈；（2）核心多糖；（3）類脂A。O-特異鏈由20～40個重復(fù)單位組成，每個重復(fù)單位由3～7個糖分子組成。它是細(xì)菌表面的主要抗原，決定型的特異性。核心多糖可分為連接O-特異鏈的外核部分和連接類脂A的內(nèi)核部分。核心多糖相對穩(wěn)定，同一菌屬結(jié)構(gòu)相同。內(nèi)核部分含有庚糖和2-酮基-3-脫氧辛酸（KDO）兩種特殊的糖類分子。它們在LPS結(jié)構(gòu)中起著連結(jié)多糖與類脂的作用。類脂A由2個葡萄糖脂、磷酸鹽和一定量的脂肪酸組成，為LPS分子中最穩(wěn)定的部分；各類Gˉ細(xì)菌均相同，它是LPS的主要毒性成分。目前認(rèn)為在LPS中只有類脂A和KDO具有毒性。LPS的共同抗原在類脂A/KDO區(qū)，常被O-特異鏈遮蓋而處于隱蔽狀態(tài)［2，3］。
2．LPS與結(jié)合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）、糖蛋白CD14：LBS為血清中一種糖蛋白，分子量為60000U，在肝細(xì)胞合成。LBP對各類細(xì)菌的類脂A均具有高度親和力，能與LPS結(jié)合形成LPS-LBP復(fù)合物，促進(jìn)LPS與單核巨噬細(xì)胞上的CD14結(jié)合。正常情況下含量較低，在應(yīng)激狀態(tài)下其含量可明顯增加。CD14是一種分子量為55000 U的糖蛋白，借助磷酸酰肌醇聚糖錨吸附于單核巨噬細(xì)胞膜表面，為LPS-LBP復(fù)合物的受體。當(dāng)LPS-LBP復(fù)合物與CD14結(jié)合后，激活有關(guān)酶系統(tǒng)，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞合成、分泌多種細(xì)胞因子，如：TNF-α、IL-1、IL-6等，TNF-α被公認(rèn)為引起內(nèi)毒素休克、MOF等炎癥反應(yīng)的主要因子。目前認(rèn)為LPS的毒性作用，主要是通過LBP和CD14這一途徑實現(xiàn)的。因為LPS-LBP復(fù)合物誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的能力是單一LPS的1000倍［4，5］。
3．LPS釋放與炎癥反應(yīng):早在一個世紀(jì)前，Jarish和Herxheimer就發(fā)現(xiàn)
二、不同種類抗生素影響Gˉ細(xì)菌LPS釋放的主要機(jī)理
1．抑制蛋白質(zhì)合成類抗生素與LPS釋放:氨基糖甙類、氯霉素類和喹諾酮類抗生素能夠抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致生長停止、增殖減慢而死亡。因而這類抗生素在多數(shù)實驗中顯示了釋放LPS緩慢，釋放量較其它種類抗生素低的特性。環(huán)丙沙星由于能引起細(xì)菌絲狀改變，仍可導(dǎo)致LPS的大量釋放。另外一些研究發(fā)現(xiàn)，G－菌的外膜表面存在鈣、鎂陽離子。正常情況下它們起連接LPS與磷脂分子的橋梁作用，能穩(wěn)定LPS分子。當(dāng)去除這些離子后，LPS會變得不穩(wěn)定而釋放出來。慶大霉素和環(huán)丙沙星可與鈣離子絡(luò)合，引起LPS釋放。這種作用能被過量的鎂離子所抑制。使細(xì)胞成分改變，造成膜的損傷，也是氨基糖甙類抗生素的作用機(jī)制之一。一些研究者認(rèn)為，氯霉素引起的腦膜炎雙球菌釋放LPS，也是由于細(xì)胞膜的損傷，造成膜成分改變，使細(xì)菌細(xì)胞壁喪失了LPS的結(jié)合力所致。環(huán)丙沙星引起的細(xì)菌絲狀改變的機(jī)理不明［8～10］。
2．干擾細(xì)胞膜通透性類抗生素與LPS釋放：Gˉ細(xì)菌細(xì)胞壁較薄而疏松，粘肽只占細(xì)胞壁的10%～20%。而含有大量的LPS、脂蛋白和雙層磷脂的外膜，其內(nèi)側(cè)為含類脂質(zhì)的胞漿膜。多粘菌素B等多肽類抗生素由肽鍵連接的環(huán)狀高分子化合物組成，結(jié)構(gòu)中有游離的-NH2和-COOH。帶正電的-NH2與Gˉ細(xì)菌胞膜中磷脂上帶負(fù)電的PO4-3結(jié)合，改變了細(xì)胞膜的通透性，使菌體內(nèi)的氨基酸、核酸、K+等成分外漏而死亡。LPS中的類脂A也含有PO4-3，故認(rèn)為多肽類抗生素具有中和LPS的能力。許多實驗已證實多粘菌素B作用于Gˉ細(xì)菌后，僅引起低而緩和的LPS釋放。細(xì)菌釋放出的LPS激活單核巨噬細(xì)胞釋放TNF-α，這一作用可被多粘菌素B抑制。如在用B型嗜血流感桿菌為模型的動物實驗中，單用頭孢他啶治療時，血中的TNF-α顯著增加，加用多粘菌素B后便抑制了約98%的TNF-α釋放。表明多粘菌素B能夠中和及減少Gˉ細(xì)菌釋放LPS，因而阻斷了由其引起的TNF-α釋放。最近發(fā)現(xiàn)氨基糖甙類也能結(jié)合LPS，但作用明顯不如多粘菌素B［11，12］。
3．青霉素結(jié)合蛋白與LPS釋放：傳統(tǒng)理論認(rèn)為，β-內(nèi)酰胺類抗生素的主要殺菌機(jī)制是抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成。因為這類抗生素都含有一個β-內(nèi)酰胺環(huán)，與細(xì)菌N-乙酰胞壁酸五肽的最后二肽，即D-丙氨酰酸相似，能竟?fàn)幗Y(jié)合轉(zhuǎn)肽酶，形成青霉噻唑酶，使其失活，轉(zhuǎn)肽過程中止，使細(xì)菌細(xì)胞滲透壓增高裂解而死亡。青霉素結(jié)合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs）是細(xì)菌胞漿膜上的一種微小蛋白質(zhì)，分子量在30000～150000 U之間。各種細(xì)菌PBPs譜不同，約3～10種，主要有6種，按分子量由大到小排序為：PBP1、PBP2、PBP3、PBP4、PBP5、PBP6。有的還有亞型：如PBP1a、PBP1b、PBP1c等。通過對底物分析，PBP1～3與肽多糖轉(zhuǎn)肽酶和葡萄糖轉(zhuǎn)移酶活性有關(guān)；PBP4～6與羧肽酶活性有關(guān)。現(xiàn)已明確，PBPs實際上是有關(guān)粘肽合成的一類催化酶-青霉素敏感酶（penicillin sensitive enzymes）。PBPs數(shù)量極少，僅占細(xì)胞膜蛋白總量的1%，每個細(xì)胞只有20～30個分子。個別的PBPs性質(zhì)已比較清楚，如PBP5為一種D，D-羧肽酶，分子量50000 U。通過一較短親水肽（20～30個氨基酸）的羧基端嵌入在胞漿膜上，其氨基端和活性部位向外。每一種PBPs與β-內(nèi)酰胺抗生素作用的詳細(xì)機(jī)制仍不清楚。目前比較重視的是PBP1～3。因為PBP1與細(xì)胞快速裂解有關(guān)；PBP2和PBP3與細(xì)菌形態(tài)改變有關(guān)，這些都與LPS釋放有關(guān)［13］。
不同的抗生素對不同的PBPs的親和力不同，同種抗生素在不同的濃度下對PBPs的結(jié)合類型也不同。如：伊米配能在1～2倍MIC(最低抑菌濃度)時，優(yōu)先與PBP2結(jié)合，使細(xì)菌成為滲透壓穩(wěn)定的大球形細(xì)胞，沒有裂解；濃度大于5倍MIC時，與PBP1親和力增加，導(dǎo)致迅速裂解。頭孢他啶在低濃度時優(yōu)先與PBP3結(jié)合，使細(xì)菌變成絲狀；高濃度時也與PBP1結(jié)合，使細(xì)菌迅速裂解。初步認(rèn)為其作用機(jī)理是，PBP1能控制細(xì)菌生長和菌體增大，是細(xì)菌生長的重要蛋白，主要功能為維持細(xì)胞形態(tài)，與抗生素結(jié)合可致細(xì)菌迅速裂解。PBP3能使細(xì)菌分裂停止，但不影響生長，故使細(xì)菌變成細(xì)長的絲狀，其長度可達(dá)原體積的30倍。PBP2的作用機(jī)理尚不清楚，可能與維持細(xì)胞有關(guān)。在一項以頭孢他啶（與PBP3結(jié)合）和伊米配能（與PBP2結(jié)合）的體外實驗表明，頭孢他啶引起的LPS釋放量大于伊米配能10倍。對于這種現(xiàn)象，目前認(rèn)為與PBP3的結(jié)合使細(xì)菌發(fā)生絲狀變，生長沒有停止，隨著菌體的伸長LPS含量也不斷增加，當(dāng)PBP1受抑止致細(xì)菌裂解時，便釋放出大量的LPS，其量明顯高于與PBP2結(jié)合的伊米配能引起的球形變（因生長停止）。兼有上述兩種變化的抗生素已在實驗室中觀察到，如美洛配能（meropenem）在濃度≤MIC時，與PBP3結(jié)合，引起絲狀變，釋放較多LPS，與頭孢他啶相似；在濃度＞2倍MIC時，與PBP2結(jié)合，出現(xiàn)球形變，釋放較少LPS，與伊米配能相似。但多數(shù)實驗表明，美洛配能主要與PBP3結(jié)合。同時也證明，伊米配能引起的LPS釋放及由此引起的TNF-α、IL-6等介質(zhì)釋放量均低于優(yōu)先與PBP3結(jié)合的抗生素，如：頭孢他啶、美洛配能、頭孢三嗪等［14～17］。
三、LPS血癥防治研究進(jìn)展
抗生素的治療，雖然能有效殺滅入侵的病原體，但隨之而來的大量LPS釋放給許多嚴(yán)重感染性疾病的救治，造成了極大困難，目前臨床上尚缺乏有效地防治辦法。盡管近年來已發(fā)現(xiàn)了許多新的拮抗劑，但多數(shù)仍停留在探索階段。另外，隨著對抗生素作用機(jī)制認(rèn)識的加深，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些抗生素具有中和或減少LPS釋放的能力。
1．免疫治療：（1）單克隆抗體（monoclonal antibody，McAb）:這類抗體種類較多，主要為IgM和IgG兩種，分別針對O-特異鏈、核心多糖和類脂A發(fā)揮作用。如：HA-1A、E5、McAb5B10、McAb8G9、McAb1B6、McAb3D10等。其中，較早應(yīng)用于臨床的HA-1A由于療效差，存在嚴(yán)重不良副作用，因而已停用。E5（抗類脂A IgM抗體）臨床應(yīng)用顯示了良好效果，能降低LPS和TNF-α，提高生存率。但對細(xì)胞結(jié)合型LPS無效。這是因為疏水的類脂A位于深部，受O-特異鏈遮蔽。但McAb1B6（Ig2A）能結(jié)合深部的類脂A。這些抗體通過中和LPS、促進(jìn)單核細(xì)胞吞噬LPS及內(nèi)在化作用發(fā)揮了良好的抗LPS作用。但這些抗體只能早期應(yīng)用，過晚由于TNF-α已被激活釋放，因而不能改善LPS引起的炎癥反應(yīng)［18］。(2)聯(lián)合免疫:由于單克隆抗體僅針對LPS，不能對已產(chǎn)生的細(xì)胞因子起作用。因而采用多種McAb聯(lián)合應(yīng)用，比單一McAb更有效。Cross等［19］進(jìn)行了由O-特異鏈McAb、J5多克隆抗血清和抗TNF-αMcAb組成的三聯(lián)免疫動物實驗。在沒有用抗生素的情況下，單用任何一種制劑的生存率為25%～43%；任何2種制劑聯(lián)合應(yīng)用的生存率為50%～60%；3種制劑聯(lián)合應(yīng)用的生存率為77%。
2．重組LPS中和蛋白：重組LPS中和蛋白（recombinant endotoxin neutralizing protein，rENP）以鱟制取，對各種細(xì)菌的LPS均有高度親和力。動物實驗表明rENP能夠顯著降低抗生素治療中的LPS和Gˉ細(xì)菌膿毒癥的病死率，其療效明顯高于HA-1A［20］。
3．LPS拮抗劑:E5531為無毒性的紅桿菌屬外膜中的類脂A成分，已由實驗室合成。E5531能竟?fàn)幗Y(jié)合LPS受體，抑制LPS介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。動物實驗表明，E5531與抗生素聯(lián)合使用，能明顯降低LPS的致死率［21］。
4．粒細(xì)胞抗菌蛋白:從多形核白細(xì)胞的嗜天青顆粒中，已分離出3種抗菌蛋白質(zhì)：(1)殺菌性通透性增加蛋白（bactericidal permeability-increasing protein，BPI）；(2)抗菌15 Ku蛋白（antibacterial 15000 U protein isoforms，P15s）；(3)中性白細(xì)胞肽（nautrophil peptides，NPs）。BPI分子量55000 U，具有強(qiáng)大的殺菌、中和LPS和抑止TNF-α分泌的能力。P15s和NPs也具有一定的殺菌、中和LPS的能力，但對長鏈LPS（S型）無作用。3種蛋白經(jīng)比較實驗，證明它們的作用強(qiáng)度為：BPI遠(yuǎn)大于P15s，而后者與NPs相同。由于PBI的全部抗菌活性基團(tuán)位于25000 u區(qū)域，因此已人工合成重組23000 U的BPI，即rBPI23。經(jīng)臨床實驗證明，rBPI23能顯著降低LPS、TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10水平，減少了中性白細(xì)胞脫顆粒作用，因而抑制了LPS引起的生物效應(yīng)。在4周的臨床實驗期中，任何受試者體內(nèi)沒有出現(xiàn)抗rBPI23抗體，肝、腎、骨髓功能無異常。除了部分受試者有短暫的皮膚潮紅外，無其它任何副作用，應(yīng)用前景十分良好［22］。
5．具有中和、減少LPS釋放類抗生素：（1）多粘菌素B：由于其獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，人們已發(fā)現(xiàn)多粘菌素B具有中和LPS的能力。許多實驗已證明，該藥單獨或與其它抗生素聯(lián)合應(yīng)用，均能減少LPS的釋放。但由于該藥抗菌譜窄，有嚴(yán)重腎毒性副作用，因而限制了該藥的應(yīng)用范圍。為此，人們已將多粘菌素B制成了復(fù)合制劑，如：多粘菌素B-右旋糖酐70、多粘菌素B-IgG等。該類復(fù)合制劑降低了腎毒性，仍保留了殺菌力和中和LPS的能力［23，24］。（2）新型β-內(nèi)酰胺類抗生素許多體內(nèi)外實驗已經(jīng)證實，凡與PBP2親和力強(qiáng)的β-內(nèi)酰胺類抗生素僅導(dǎo)致較低的LPS釋放。已發(fā)現(xiàn)的這類抗生素有伊米配能、克拉維酸、氮卓脒青霉素、頭孢諾米、頭孢吡肟等。目前證明效果最好的是伊米配能。一項臨床對照實驗表明，LPS毒血癥患者，經(jīng)治療4小時后，伊米配能（與PBP2結(jié)合）組的3例患者LPS水平已降低；頭孢他啶（與PBP3結(jié)合）組的4例患者LPS水平?jīng)]有降低，其中2例患者的LPS水平增加了。正在開發(fā)的新一代碳青霉烯類抗生素L-627（biapenem），不需與脫氫肽酶Ⅰ抑制劑聯(lián)用，殺菌作用更強(qiáng)，副作用更輕，尤其對大腸桿菌PBP2、PBP4，綠膿桿菌PBP1a、PBP2、PBP4顯示出強(qiáng)的親和性。其特性明顯優(yōu)于第一代的伊米配能。而另2種已上市的碳青霉烯類抗生素美洛配能和帕尼配能（penipenem），主要與PBP3結(jié)合，無降低LPS的作用。選用優(yōu)先與PBP2結(jié)合的抗生素，既能殺菌，又能減少LPS的釋放，可以提高嚴(yán)重感染性疾病的救治水平［14，16，17，25，26］。
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（收稿 ：1998-02-25 修回：1998-09-16）
