一．ELISA試驗(yàn)有效性與三項(xiàng)對照
什么是“有效性”（Validity）？要獲得準(zhǔn)確的檢測結(jié)果“有效性”評價(jià)，就會關(guān)系到：為什么要設(shè)置“陰性、陽性和空白”等不可缺少的三項(xiàng)對照？要用什么樣的物質(zhì)擔(dān)當(dāng)“陰性、陽性和空白對照（品）”？這“三項(xiàng)對照”如何設(shè)置、需要設(shè)置幾個(gè)孔位？獲得的測定值如何“認(rèn)可、取舍與計(jì)算”？隨后，又如何依照陽性對照均值（PCx）與陰性對照均值（NCx）的差值（P-N，或N-P）大小做出“試驗(yàn)結(jié)果有效性”的最終裁決呢？…等等，這一連串的問題，在國外“正規(guī)”品牌的ELISA試劑《使用說明書》中都有明細(xì)和詳盡的說明。既有理論要點(diǎn)提示，又有具體細(xì)致的舉例解說。很可惜，在90年前后，國內(nèi)興起ELISA檢測熱潮之際，在一片“國外試劑說明書太詳細(xì)、太復(fù)雜、不容易看明白、…”等等“一片埋冤”聲中，正好迎合國內(nèi)商家的“意愿”。從此以后，國產(chǎn)ELISA試劑的說明書，越來越簡單。這其中商家就有兩個(gè)“好處”：好處之一，用A4、或B5，甚至比B5還要小的一張紙，代替國際試劑的好幾頁的“使用說明書”（等同于一份“操作手冊”），每年就可節(jié)省一大筆印刷成本費(fèi)；好處之二，如同國際試劑說明書上向用戶交待的各種表明本試劑質(zhì)量有關(guān)的詳盡內(nèi)容，國產(chǎn)試劑的所謂“說明書”上統(tǒng)統(tǒng)可以“刪除、回避、拒絕”向用戶通報(bào)和承諾。我90年前后收集的<美>雅培、<法>巴斯德、<荷>阿克蘇等相關(guān)試劑的原文說明書，幾經(jīng)搬動全都處理，很是可惜。近日，杭州檢疫局朋友送了一份生物梅里埃中國有限公司的中文版《人類免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）使用說明書》。對照閱讀之下，深深感到這才是一份真正意義上的《使用說明書》呀！在我下文提到的若干“概念、問題”，從中都可以找到答案。我現(xiàn)在參照我本人1993年的《肝炎ELISA試劑質(zhì)量與檢測結(jié)果有效性評價(jià)》會議講稿相關(guān)內(nèi)容，就“三項(xiàng)對照與檢測結(jié)果有效性”表示如下認(rèn)識和討論。
二．三項(xiàng)對照要求與用途
ELISA檢測，按照試劑說明書要求，每次試驗(yàn)、每塊扳上都要設(shè)置以下3項(xiàng)對照和用途：
1．空白對照：僅用稀釋液代替檢測樣本、用以觀測最終反應(yīng)的顯色“本底”、并用于酶標(biāo)儀消除、扣除“本底”，即：以本底為“零”讀取陽性、陰性對照孔和樣本檢測孔的吸光值（A）；或者，在計(jì)算陰性對照均值（NCx）、陽性對照均值（PCx）、樣本讀數(shù)的S/C.O.值時(shí)減去空白對照的本底吸光值。早年的酶標(biāo)儀無自動扣除空白對照孔讀數(shù)功能，這種酶標(biāo)議現(xiàn)已淘汰不用了，寫上這段話的意思是補(bǔ)充說明設(shè)置空白對照的用途?？瞻卓拙唧w如何讀取讀數(shù)，則依照說明書操作。例如，生物梅里埃中國有限公司的中文版《人類免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）使用說明書》上提示：以空氣讀空白（不放板架和板條），在450nm（單波長）、或450nm和620—700mn（底物是TMB）參考波長進(jìn)行讀數(shù)。
2．陰性對照（品）：
（1）陰性對照（品）的概念與要求：所謂陰性對照（品），應(yīng)當(dāng)是本項(xiàng)檢測試驗(yàn)中采用與待撿物（樣品、人用試劑就是人的血清等）具有同源性和同質(zhì)性，又不含有待檢物質(zhì)，并能客觀比較和鑒別處理因素（血清免疫學(xué)試驗(yàn)中有特異性抗原與抗體反應(yīng)）之間的差異。因此，用動物血清或其制品（如牛血清白蛋白等）代替陰性人血清作為對照品，從理論和實(shí)踐上都是不可取的，弊端甚多，無須細(xì)述。注意：據(jù)我所知，國產(chǎn)ELISA試劑中，有的廠牌是用動物血清制品稀釋配置、或與部分人血清混合配置的；其二，陰性對照讀數(shù)，并非是“越低越好”。NCx值接近0.00X水平，這是假象！試想一下，真正采用“陰性人血清”的陰性對照品，NCx值會如此之低嗎？舉個(gè)例子，雅培乙肝六項(xiàng)EIA試劑的NCx值，分別為：0.010（HBsAg）、0.027（抗—HBs）、0.035（HBeAg）、1.083（抗—HBe）、1.065（抗—HBc）、0.045（抗HBc-IgM）。生物梅里埃的HIV試劑NCx是0.091。辨別試劑NCx值是否合理的一個(gè)很簡單的方法，只要對比大量陰性樣本的實(shí)際讀數(shù)就“一目了然”啦！
一個(gè)題外插曲：表明ELISA試劑內(nèi)在質(zhì)量的一個(gè)重要統(tǒng)計(jì)標(biāo)志，就是要看：陰性樣本的的上限不應(yīng)當(dāng)大于、必須小于C.O.I.=1.00；反之，陽性樣本的的下限不可小于、應(yīng)當(dāng)大于C.O.I.=1.00！早年我用SPSS軟件輸出阿克蘇HIV和國產(chǎn)甲、乙試劑檢測600例左右的健康人體檢血清的三幅直方圖，可以表明陰性樣本的不同分布特征，頗有意思。
我為什么要如此細(xì)說NCx呢？因?yàn)镹Cx值在Cut off值計(jì)算中是相當(dāng)舉足輕重的（詳后）。
（2）陰性對照（品）分為兩類
一是代表受檢人血清中并不含有、或方法學(xué)靈敏度未能檢出的待檢物的基準(zhǔn)水平，并且是結(jié)果判斷值（Cut off）計(jì)算式中決定“是”（陽性）、或“否”（陰性）的唯一可變值。陰性對照值高，導(dǎo)致假陰性；反之，導(dǎo)致假陽性。如：HBsAg、HBeAg、抗—HBc等。二是陰性對照設(shè)置，在方法學(xué)上要求加入指示性定量標(biāo)準(zhǔn)品，如中和劑HBeAg，定量HBcAg等，用以檢測抗—HBe、抗—HBc。或者，選取代表平均水平的正常人血清用作陰性對照，如檢測抗—HBc IgM。此類Cut off 值計(jì)算時(shí)，多數(shù)均包括陰性和陽性對照值2個(gè)可變值。
3．陽性對照（品）：
（1）陽性對照（品）的概念與要求：同陰性對照（品），只是采用“精選”的含有待檢物質(zhì)的人血清制備而成。所謂“精選”，就是把收集的陽性人血清經(jīng)過數(shù)種試驗(yàn)進(jìn)行“篩試”、把含有“干擾性物質(zhì)”的血清剔除、不用，以避免出現(xiàn)“假陽性”干擾試驗(yàn)結(jié)果。
（2）陽性對照（品）設(shè)置，也可區(qū)分為兩種類型與用途：
一是陽性對照主要用于評價(jià)該項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果是否有效和試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性與可比性。而所設(shè)的陽性對照的測量值不列入Cut off值計(jì)算、但是不可不做。如HBsAg、抗—HBs、HBeAg等。
二是陽性對照的設(shè)置，不僅用于評價(jià)試驗(yàn)結(jié)果是否有效和試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性與可比性，而且計(jì)入Cut off的計(jì)算。此時(shí)的Cut off值的含義是代表該標(biāo)志物在健康（正常）人群中正常值范圍的上限。待檢樣本檢測值超過該上限（Cut off）時(shí)表示有診斷意義。例如抗—HBe、抗—HBc、抗—HBc IgM等。
H
三．陰性與陽性對照平均值計(jì)算與判斷
1．陰性對照平均值NCx有效性計(jì)算判斷舉例：
（1）第一類NCx計(jì)算與評價(jià)：以HBsAg為例
Ⅰ. 設(shè)置3孔的NCx計(jì)算：NCx=（0.011+0.010+0.090）/3=0.010
Ⅱ. 任一個(gè)NC值應(yīng)≤0.100至≥－0.010；
Ⅲ. 各NC值也應(yīng)介于≥0.5×NCx至≤1.5×NCx之間。此時(shí)各孔的NC值均處于NCx±0.006范圍內(nèi)，其中遇有一孔NC值偏離該范圍時(shí)，則棄去該NC值，再計(jì)算NCx。如有2孔NC值超出該范圍時(shí)，本次試驗(yàn)（無效）應(yīng)予復(fù)試。
Ⅳ. 不同廠牌對NCx的具體要求略有不同，但總的原則幾為一致，如<法>巴斯德HBsAg EIA Kit。
（2）第二類NCx計(jì)算與評價(jià)：可包括抗—HBc、抗—HBe。以抗—HBc、抗—HBe為例：
Ⅰ. 取3孔陰性對照A值的平均值：
抗—HBc NCx=（1.027+0.989+1.278）/3=1.065
抗—HBe NCx=（1.169+1.088+0.993）/3=1.083；
請各位注意：這2個(gè)NCx是不是很接近1.00呀？也就是說，十分接近C.O.I.（C.O./S，或C.O./A）=1.00！這不是一種偶然，而是國際試劑（如雅培）的“質(zhì)量”標(biāo)志。如果偏大，例如1.50以上，或者偏小，0.50以下，待檢樣本中會導(dǎo)致出現(xiàn)什么現(xiàn)象呢？請讀者自己思考吧。
Ⅱ. 各孔NC值均應(yīng)＜2.000，并處于≥0.5×NCx至≤1.5×NCx之間。若其中1孔NC值偏離該范圍時(shí)，棄去，再計(jì)算2孔的NC值的NCx。如有2孔NC值偏離該范圍時(shí)，應(yīng)重新試驗(yàn)。
2．陽性對照平均值PCx有效性計(jì)算與評價(jià)也分為兩類：
（1）第一類 PCx計(jì)算與評價(jià)：以HBsAg為例 DauI*sZmR
Ⅰ. 第一類PCx的計(jì)算不列入Cut off計(jì)算，可?。ㄔO(shè)）2—3孔陽性對照的平均值PCx（Abbott）： PCx=（1.024+1.030）/2=1.027。注意：本例雅培試劑HBsAg的Cutoff值=NCx+0.05=0.06，PCx 的S/C.O.=1.027/0.06=17.12。如果S/C.O.超過20.00以上，提示HBsAg陽性對照含量太高！
Ⅱ. 參照方法學(xué)的要求，也可規(guī)定PCx應(yīng)≥1.000（指A值），而且各孔PC值要求≥0.5×PCx 至≤1.5×PCx
Ⅲ. PC的設(shè)置及PCx的計(jì)算，主要用于評價(jià)本次試驗(yàn)結(jié)果是否有效和各批/次試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和可比性，并不參與Cut off值的計(jì)算。同一個(gè)批號試劑及其陽性對照品在規(guī)定保存條件和有效期內(nèi)，各次試驗(yàn)時(shí)PCx值也應(yīng)保持相對穩(wěn)定水平。換句話說，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性評價(jià)時(shí)，也應(yīng)觀測陽性對照的“統(tǒng)計(jì)過程控制”（SPC）處于穩(wěn)定狀態(tài)—輸出“控制圖”。
（2）第二類PCx的計(jì)算與評價(jià)：也以抗—HBc為例
Ⅰ. 可?。ㄔO(shè)）2—3孔PC 的A值得平均值PCx： PCx=（0.051+0.038）/2=0.045
Ⅱ. 參照方法學(xué)要求，也可規(guī)定各孔PC值應(yīng)處于≥0.5×PCx 至≤1.5×PCx范圍內(nèi)。
Ⅲ. PCx值參與Cut off值的計(jì)算，例如抗—HBc的Cut off（Abbott）：
Cut off=0.4（NCx）+0.6（PCx）。
該值（Cut off）可以理解為：指示性定量HBcAg反應(yīng)值的40%加定量抗—HBc反應(yīng)值的60%之和，恰為健康人群血中抗—HBc正常值范圍的界限。任一待檢樣本的檢出值低于該Cut off值時(shí)則判為抗—HBc陽性，大于該Cut off值時(shí)則判為抗—HBc陰性。
3．計(jì)算NCx、PCx有效性與統(tǒng)計(jì)控制應(yīng)用
讀者如果注意到NCx與PCx有效性計(jì)算規(guī)則，很有點(diǎn)像電視上的“去掉一個(gè)最小值、去掉一個(gè)最大值”的評分辦法，就知道統(tǒng)計(jì)學(xué)上的異常值“粗略”取舍法，把3個(gè)對照值中的1個(gè)最小、或最大“異常值”剔除，再重新計(jì)算余下的2個(gè)對照值的平均值。這樣，不但可以比較前、后試驗(yàn)的各次反應(yīng)板之間的NCx與PCx的波動狀態(tài)，用這樣的NCx、PCx去繪制控制圖，也可以減少因?yàn)楹挟惓Ｖ档钠骄翟斐傻?ldquo;假失控”機(jī)率。況且，無論是單值控制圖、或是均值控制圖，質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)中是不應(yīng)當(dāng)含有“異常值”數(shù)據(jù)的。
4．ELISA試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)控制如何借鑒PCx有效性計(jì)算與應(yīng)用，擬在另文中討論。
四．計(jì)算P-N與N-P差值的意義用途
1．國際品牌的EIA試劑，很注重觀測陽性與陰性（P-N）、或陰性與陽性（N-P）對照均值之間的差值，以及P/N（或N/P）比值與C.O.I.指數(shù)的比較，并把它視為：在評價(jià)試劑質(zhì)量或判斷試驗(yàn)結(jié)果有效性時(shí)是不可或缺的評價(jià)指標(biāo)。我用雅培的EIA乙肝試劑為例列表如下（見附表4—1）：
附表4—1 HBsAg（a、b、d法）抗—HBsHBeAg抗—HBe抗—HBc抗—HBc-IgM
CutoffNCx+0.05NCx+0.05NCx+0.060.5(NCx)+0.5(PCx)0.4(NCx)+0.6(PCx) 0.25(PCx)+NCx
P-N或N-P≥0.400≥0.300≥0.300≥0.300≥0.300≥0.300
1.027-0.010=1.0171.447-0.027=1.4201.202-0.035=1.1671.083-0.040=1.0431.065-0.0481.0170.846-0.045=0.801
P/N（或N/P）與A/C.O.（或C.O./A）比較
P/N=1.027/0.01=102.7A/C.O.=1.027/0.06=17.121.447/0.027=53.591.447/0.077=18.791.167/0.2533.341.167/0.095=12.28N/P=1.083/0.040=27.08C.O./A=0.562/0.01=14.051.065/0.045=23.670.453/0.045=10.07P/N=0.846/0.045=18.8A/C.O.=0.846/0.257=3.29
例如：HBsAg的P-N要求≥0.400（A、B、C法），其它各項(xiàng)試劑要求＞0.400或0.300。P-N或N-P意義是：如果小于0.400或0.300，需考慮試驗(yàn)操作有誤；如復(fù)試后仍小于0.400或0.300，則考慮試劑失效。
同樣說法，用P/N或N/P比值與C.O.I.指數(shù)的比較，也是提供實(shí)驗(yàn)者觀測實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否有效、可否成立的參考水平。
—敬請注意，國內(nèi)有的EIA試劑配套提供的陽性（PC）或陰性（NC）對照物含量過高，達(dá)到、甚至超過部臨檢中心臨床高值血清的含量。此時(shí)，不能參與上述的N-P、或P-N的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價(jià)。
2．可以反過來提問：國際品牌試劑說明書就如此可靠、可信嗎？我的答復(fù)是：實(shí)際用過國際品牌試劑后，您就會獲得如下感受和觀點(diǎn)：如此詳細(xì)的試劑使用說明書，就相當(dāng)于一份相當(dāng)完整的質(zhì)量保證指導(dǎo)書，正如<生物梅里埃中國有限公司的中文版《人類免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）使用說明書》>中所鄭重聲明的：14 性能特點(diǎn)當(dāng)按照說明書正確操作、結(jié)合適當(dāng)?shù)臋z測儀器以及相關(guān)附件或者生物梅里埃公司的設(shè)備時(shí)，生物梅里埃公司保證這個(gè)體外診斷試劑正確的實(shí)驗(yàn)性能。請大家體會一下，國際品牌試劑竟有如此膽量、敢于公開做出如此的書面承諾，靠的是什么？就是當(dāng)前的一句名言：靠品牌意識、靠ISO的質(zhì)量管理和保證。
至于說明書中提供的計(jì)算舉例（附表4—2），包括：NCx=0.091，清除異常的質(zhì)控對照，確定PC1-NCx≥0.600、PC2-NCx≥0.600、PC3-NCx≥0.400，計(jì)算界限值（Cut off）等等，其引用的具體數(shù)據(jù)，不是臆造、不是寫著好看的，而是參照正常的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)舉例演算、可供用戶參考對比的。如果您的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與附表4—2中舉例的數(shù)據(jù)相差太大、太離譜，它可以提示您“多加思考、找找原因”。如果有網(wǎng)友也在用生物梅里埃公司的HIV試劑，不妨用您的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對照一下，是不是這個(gè)情況，向大家說說。
3．如果再注意說明書上的其它信息，例如說明書中的表2、3、4、5都是很值得細(xì)看和推敲的：/ *; （1）HIV—抗體陽性樣品診斷敏感性：不僅是3個(gè)100%，而且更要注意它的陽性樣本的數(shù)量是445、200和303份（附表4—3），這可是頗為可觀的樣本數(shù)量哦！如果該公司選用的抗體陽性樣本是按照WHO的要求預(yù)先已經(jīng)用蛋白印跡法確認(rèn)為HIV—1、2、型抗體和抗原陽性血清，那么，附表4—2敏感性的3個(gè)100%是很有“高度”指導(dǎo)價(jià)值的。
附表4—3 抗體陽性樣品的診斷敏感性
樣本數(shù)量敏感性
445份HIV—1抗體陽性標(biāo)本100%
200份HIV—2抗體陽性標(biāo)本100%
303分HIV抗原陽性100%
（2）再看分析特異性附表4—4提示多達(dá)4796例的獻(xiàn)血員標(biāo)本特異性竟然有99.9%！如果是按照WHO的要求，可參考Bull.WHO.70(6)：751-，1992；72（1）：129-，1994，這4796例獻(xiàn)血員標(biāo)本事前經(jīng)過蛋白印跡法確認(rèn)是HIV陰性樣本的話，那么，附表4—3的3個(gè)100%，才是真正的頂級國際水平，實(shí)在令人驚喜。再看附表4—5列舉人血清中對于ELISA檢測會產(chǎn)生“非特異性干擾”的9種物質(zhì)（成份）檢測全部“陰性”的結(jié)果，也很有臨床參考價(jià)值。這2幅附表提供如此重要的敏感性和特異性的數(shù)據(jù)信息，在國產(chǎn)試劑說明書中是難以查悉的。
五．陽性與陰性灰?guī)?
此處所指陽性與陰性灰?guī)?，既是試劑本身的質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)，也是判斷待檢樣本中是否有需要重復(fù)復(fù)檢的可疑樣本范圍（Sample Retest Range），及各批/次試驗(yàn)時(shí)可疑樣本占有率。例如雅培EIA乙肝試劑的陽性與陰性灰?guī)?要求如下：HBsAg定為0.0%，意思是：不應(yīng)當(dāng)有陽性或陰性“灰?guī)?rdquo;樣本；其余各項(xiàng)目都是10.0%。這又是一個(gè)負(fù)責(zé)任的對試劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的公開承諾！
這兒說的“灰?guī)?rdquo;，就是：待檢樣本判為“可疑”的S/C.O.=1.00＋/－10%的范圍、該樣本需要復(fù)檢。
六．筆者附注：.
筆者一點(diǎn)感想：我90年開始接觸ELISA，當(dāng)時(shí)詳細(xì)講解ELISA的書籍并不多。隨后的數(shù)年中，借助應(yīng)用過幾個(gè)品牌進(jìn)口試劑的機(jī)會，從反復(fù)閱讀原版試劑說明書中逐漸地悟出了有關(guān)EIA試劑質(zhì)量的一些“理解與心得”。這些“理解與心得”，從當(dāng)時(shí)的國產(chǎn)試劑說明書上是難以查詢獲得的。我寫這一段話，意思是希望朋友們，是否找一篇國際上標(biāo)準(zhǔn)的EIA試劑使用說明書細(xì)細(xì)地讀一讀，比如生物梅里埃中國有限公司的中文版《人類免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）使用說明書》，并與國產(chǎn)ELISA試劑說明書對比著看看，我想大家一定會有不同的感受。
本篇文章來源于 檢驗(yàn)在線 http://www.labbbs.com
|
