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          生物知識

          雞白介素-4(IL-4)ELISA試劑盒說明書

          作者:admin 來源:本站 發(fā)布時間: 2010-12-24 08:37  瀏覽次數(shù):
          購買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 m.kjhfd.cn

          雞白介素-4(IL-4)ELISA試劑盒試劑盒僅供研究使用                                       

          預(yù)期應(yīng)用
          ELISA法定量測定雞血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中IL-4含量。

          實驗原理
          本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中白介素-4水平。用純化的抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入白介素-4抗原、生物素化的抗雞白介素-4抗體、HRP標(biāo)記的親和素,經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的白介素-4呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計算樣品濃度。
          試劑盒組成
          1.         酶聯(lián)板:一塊(96孔)

          2.         標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品):2瓶,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,其濃度為10 ng/mL,做系列倍比稀釋后,分別稀釋成5 ng/mL,2.5 ng/mL,1.25 ng/mL,0.62 ng/mL,0.31 ng/mL,0.16 ng/mL,0.08ng/mL其原液直接作為最高標(biāo)準(zhǔn)濃度,樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/mL,臨用前15分鐘內(nèi)配制。

          如配制5 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品:取0.5ml 10 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。

          3.         樣品稀釋液:1×20ml/瓶。

          4.         檢測稀釋液A:1×10ml/瓶。

          5.         檢測稀釋液B:1×10ml/瓶。

          6.         檢測溶液A:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液A1:100稀釋。稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制(每孔100ul),實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制。

          7.         檢測溶液B:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液B1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

          8.         底物溶液:1×10ml/瓶。

          9.         濃洗滌液:1×30ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

          10.     終止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

          標(biāo)本的采集及保存

          1.細(xì)胞培養(yǎng)物上清:請離心后收集上清,并將標(biāo)本保存于-20℃,且應(yīng)避免反復(fù)凍融。

          2.血清:標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

          3.血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

          注:標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。
           
           
          操作步驟
          實驗開始前,請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?,試劑或樣品稀釋時,均需混勻,混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時,用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋,以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

          1.         加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔??瞻卓准訕悠废♂屢?00ul,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,37℃反應(yīng)120分鐘。

          為保證實驗結(jié)果有效性,每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

          2.         棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul(取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制),37℃,60分鐘。

          3.         溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干。

          4.         每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液) 100ul,37℃,60分鐘。

          5.         溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干。

          6.         依序每孔加底物溶液90ul,37℃避光顯色(30分鐘內(nèi),此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯,即可終止)。

          7.         依序每孔加終止溶液50ul,終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。

          8.         用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。

          注:

          1. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,該孔不加任何試劑,只是最后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。

          2.為防止樣品蒸發(fā),試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。

          3.  未使用完的酶標(biāo)板或者試劑,請于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。

          4.  建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

           
          洗板方法
          手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實驗臺上鋪墊幾層
          吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。
              自動洗板:如果有自動洗板機,應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
          特異性
              本試劑盒可同時檢測重組或天然的雞白介素-4,且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

          計算
            以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo)),OD值為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo)),在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。

          注意事項
          1.  洗滌過程非常重要,不充分的洗滌易造成假陽性。

          2.  一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。

          3.  請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線,最好做復(fù)孔。

          4.  如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,請先稀釋后再測定,計算時請最后乘以稀釋倍數(shù)。

          5.在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時,請以相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。

          6.底物請避光保存。

          檢測范圍:
          0.08 ng/mL --10 ng/mL

          說明
          1.試劑盒保存:-20℃(較長時間不用時);2-8℃(頻繁使用時)。

          2.有效期:6個月

          3.濃洗滌液會有鹽析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶。

          4.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),此為正常現(xiàn)象,不會對實驗結(jié)果造成任何影響。

          5.中、英文說明書可能會有不一致之處,請以英文說明書為準(zhǔn)。

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