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胚胎冷凍儀(程序降溫儀） http://m.kjhfd.cn/a/gb2312/yiqi/CryoLogic/2010/0428/3073.html 胚胎冷凍程序及方法
要點
•胚胎冷凍效果依賴于體外受精的成功率。如果新鮮胚胎的體外受精的效果不好，冷凍效果也會不好。
•成功的胚胎冷凍需要穩(wěn)定精確的冷凍儀器，形態(tài)良好的胚胎及配子，以及精細的實驗室操作。
儀器及耗材清單
1 程序冷凍儀:澳大利亞Cryologic公司 CL8800程序降溫儀
2 液氮儲存罐:用于保存人的胚胎或細胞。
3 麥管或塑料冷凍管:無毒、無菌、質量優(yōu)良。
4 冷凍及解凍液:FREEZE-KIT1/THAW-KIT1
(含有丙二醇)。FREEZE-KIT2/THAW-KIT2(含甘油與蔗糖)。
5 液氮使用量的多少由冷凍儀的類型以及儲存罐的大小決定。
應在對細胞造成最小損害的情況下對其進行冷凍與解凍。細胞冷凍就是使用冷凍保護劑將細胞脫水以防止或減少在冷凍過程中發(fā)生細胞損傷。選擇適宜的溫度梯度將會有利于細胞的冷凍，同時還會使細胞最大程度脫水。在冷凍過程使用冷凍保護劑，將會降低細胞由于冷凍液的高滲透壓及較高濃度而造成的危害。
不同的胚胎發(fā)育階段需要不同的冷凍保護劑。1,2-丙二醇是原核卵與早期胚胎冷凍最常用的冷凍液，而囊胚期胚胎則常用甘油。冷凍及解凍過程的順利與否是細胞能否存活的關鍵，而在液氮里儲存胚胎則不會對其產(chǎn)生有害作用。
首先將胚胎放人冷凍保護劑中然后再放進麥管。接著用生理冷凍儀精確地降低麥管的溫度。在冷凍液接近冰點時用液氦冷凍過的鑷子誘導麥管液體結晶。該過程又稱為植冰或冰核形成。如果不進行植冰或者植冰不充分，那么胚胎將會由于脫水不完全以及發(fā)生自植冰而遭受一定的損害。胚胎外植冰是胚胎脫水是否完全的關鍵點。
隨著胚胎外無滲透能力溶劑濃度的增加以及胚胎外水分的結晶，胚胎內水分將會不斷脫出脫水過程一直持續(xù)到胚胎達到冰點。如果冷凍過程太快胚胎脫水將會不完全。
如果胚胎解凍太慢，在緩慢升溫過程中超冷水將會在細胞內發(fā)生結晶從而損害胚胎。胚胎解凍的速度一般由冷凍劑的類型及-40℃以下的冷凍速率所決定。如果胚胎冷凍過程較快(例如緩慢冷凍到-40℃)，那么解凍速率也要快(直接放人30℃溫水中，500℃/分)。如果冷凍過程較慢(例如緩慢冷凍到-80℃)，那么解凍速率必須為10℃/分。丙二醇及甘油都需要快速解凍。
FREEZE-KITTM/THAW-KIT1TM
該方法可用于從原核階段的卵子到8細胞胚胎的冷凍TM，該方法由TESTART
1986年的冷凍方法改進而來，使用丙二醇作為滲透性冷凍保護劑。蔗糖為非滲透性冷凍保護劑。蔗糖是一種能夠促使細胞脫水的生物大分子，而且還能夠在胚胎解凍時防止細胞溶解。因為各個步驟都是在培養(yǎng)箱外室溫下進行的，因而須用磷酸鹽緩沖液穩(wěn)定PH波動。
FREEZE-KIT1TM成分：
Cryo-PBS: PBS+25mg/ml HSA
溶液1(FS1):1.5M丙二醇+ Cryo-PBS
溶液2(FS2):1.5M丙二醇+0.1M蔗糖+ Cryo-PBS
冷凍程序舉例
起始溫度 18℃
第一步 -2.0 ℃到–7.0℃
第二步 -7.0℃停留10分鐘，2分鐘后植冰（seeding）
第三步 -0.3℃到-30.0℃
第四步 -30.0℃到 -80.0℃ -1℃（至少10.0℃/分）
將麥管拿出并放進液氮罐中（為于液面以下，不要位于汽相）儲存。
要點
• 因為胚胎解凍質量與胚胎起始質量密切相關，因此冷凍保存的必須是高質量胚胎。
• 在冷凍操作開始之前要仔細檢查患者身份并且準備冷凍記錄。
冷凍操作步驟
1 準備適當體積的冷凍液Cryo-PBS、FS1及FS2，并室溫平衡。
2 將胚胎放入Cryo-PBS，觀察并記錄詳細的形態(tài)變化（2-5分鐘）。
3 然后將胚胎緩緩放入FS1保持10分鐘（不要超過20分鐘）。胚胎將會發(fā)生皺縮，隨即又會達到平衡。
4 將胚胎放入FS2，然后用1ml注射針接到麥管上并將胚胎放入麥管。拿出麥管封口以防液氮漏入。
5 將麥管放進冷凍儀，開始冷凍程序。
6
-7.0℃時用液氮浸透過的棉簽在接近麥管上部的部位進行植冰。一定不要在接近胚胎的部位植冰。不要將麥管拿出或者搖動。如果植冰部位有氣泡胚胎的存活率將會下降。繼續(xù)冷凍程序。
7 整個冷凍程序大約需要2小時，必須注意麥管低溫時極易發(fā)生解凍。將麥管放入液氮罐，-196℃保存。
THAW-KIT1TM成份：
溶液1(TS1):1.0M丙二醇+ 0.2M蔗糖+Cryo-PBS
溶液2(TS2):0.5M丙二醇+0.2M蔗糖+ Cryo-PBS
溶液3(TS3):0.2M蔗糖+ Cryo-PBS
要點
• 解凍麥管時必須一次成功。
• 解凍操作在室溫下進行（18-20℃）
• 確認患者身份并進行記錄。
解凍操作步驟
1
確認患者身份找出相應麥管，并進行記錄。將解凍液器皿上標上記號TS1，TS2，TS3及Cryo-PBS。
2 拿出麥管室溫下解凍30秒。室溫解凍時必須仔細檢查麥管內是否有氣泡、裂痕或者液氮滲漏。
3
將麥管放進30℃水中浴30秒。拿出小心擦干。消毒剪去一端，接上1ml注射器。然后剪去另一端，注意不要晃動以免造成氣泡。
4
小心地將胚胎吹入TS1中。觀察胚胎是否從麥管中被吹了出來，如果沒被完全吹出來，應當吸取一點液體再次。胚胎可能會偶爾黏附在麥管壁上。
5 在TS1中孵育5分鐘。
6 小心地將胚胎移入TS2保持5分鐘。
7 移入TS3中5-10分鐘。滲透壓變化使質膜變脆弱。
8
將胚胎放進室溫Cryo-PBS，接著放入37℃器皿中保持10分鐘。不要放入二氧化碳培養(yǎng)箱，因為Cryo-PBS對5%CO2的緩沖能力不足。
9
然后可以將胚胎放入IVFTM、G1.2TM或者G2.2TM中。檢測胚胎存活率并評價胚胎形態(tài)。這時的胚胎可以立即進行移植，也可以在培養(yǎng)一段時間后移植。原核卵子應當在IVFTM或者G1.2TM中培養(yǎng)過夜，如果分裂正常才能進行移植。
10
解凍操作過程對胚胎冷凍成功與否也極為關鍵。確保在適宜的時間將胚胎移植進入受體子宮。冷凍胚胎既可以在自然周期，在可以在人工周期移植。
FREEZE-KIT2TM/THAW-KIT2TM
FREEZE-KIT2TM/THAW-KIT2TM-冷凍/解凍法該方法由HARSHORNE等人的方法改編而來，用于囊胚的冷凍。
FREEZE-KIT2TM成份：
Incubation
1%的甘油
2%的甘油
4%的甘油
6%的甘油
8%的甘油
冷凍程序舉例
第一步 從室內環(huán)境溫度至-7℃，溫度下降速率為1℃/分。
第二步 在-7℃停留5分鐘并植冰（seeding）。
第三步 從-7℃慢慢降溫至-30℃，溫度下降率為0.3℃/分。
第四步 從-30℃迅速降溫至約-150℃。
第五步 將麥管立即投入液氮罐（-196℃）
要點
• 因為胚胎解凍質量與胚胎起始質量密切相關，因此冷凍保存的必須是高質量胚胎。
• 在冷凍操作開始之前要仔細檢查患者身份并且準備冷凍記錄。
冷凍操作步驟：
1 檢查并啟動冷凍儀CL8800。
2
準備六個FALCON或者幾個四孔皿，依次標記Incubation、1%、2%、4%、6%、及8%。
3 在各孔中依次加入適量的冷凍液。
4 將培養(yǎng)皿在37℃及5%CO2條件下平衡1小時。步驟5-10的培養(yǎng)條件與此相同。
5 將胚胎移入Incubation中孵育5分。
6 將胚胎移入1%的甘油不孵育10分。
7 將胚胎移入2%的甘油不孵育10分。
8 將胚胎移入4%的甘油不孵育10分。
9 將胚胎移入6%的甘油不孵育10分。
10 將胚胎移入8%的甘油不孵育10分。
11
用1mL注射針管將懸浮于8%冰凍液中的胚胎吸入麥管。冷凍液會浸入石棉塞，并會使其膨脹以堵住麥管。另一端封口，可用鑷子燒熱將麥管另一端熱融封口。
12 拿出麥管熱封，貼上標簽裝入冷凍儀。
13 立即啟動冷凍程序。
14 在-7℃，用液氮冷凍的鑷子植冰或用棉簽在程序降溫儀液氮浴桶內蘸少許液氮進行植冰。
15 繼續(xù)執(zhí)行冷凍程序，最后快速拿出麥管移入液氮。
16 然后將麥管放入儲存罐。
THAW-KIT 2TM 成份：
8%的甘油
6%的甘油
5%的甘油
4%的甘油
3%的甘油
2%的甘油
1%的甘油
Incubation
要點
一次解凍一支麥管
確認患者身份并進行記錄
解凍操作步驟：
1準備九個FALCON培養(yǎng)皿或者幾個四孔皿，依次標記8%、6%、5%、4%、3%、2%、1%和兩個Incubation皿。
2吸取適當體積的解凍液。另外準備一個G2.2TM或CCMTM培養(yǎng)皿。
3在37℃與5%CO2條件下平衡1小時。
4用37℃溫水裝滿一個大燒杯。
5將麥管迅速從儲存罐中取出，放進盛有液氮的容器，再次檢查患者身份。
6從液氮中拿出麥管，用紗布迅速擦干并開始記時。用帶有標記的鑷子持住麥管在空氣中解凍30秒。觀察麥管是否漏液。
7將麥管輕輕放進30℃溫水中孵育40-50秒。
8拿出麥管，用紗布擦干，然后用剪斷麥管熱封一端，接上注射針管。剪斷石棉封口端，將囊胚推注到8%冰凍液中。如果沒有胚胎，應再次沖冼麥管。將胚胎在8%甘油中放置5分鐘。
9將胚胎轉移到6%甘油中，并在37℃5%CO2條件下孵育10分。步驟10-14的培養(yǎng)條件與此相同。
10將胚胎轉移到5%甘油中孵育12分。
11將胚胎轉移到4%甘油中孵育12分。
12將胚胎轉移到3%甘油中孵育12分。
13將胚胎轉移到2%甘油中孵育12分。
14將胚胎轉移到1%甘油中孵育12分。
15用Incubation沖冼胚胎兩次。
16將胚胎移入G2.2TM或CCMTM培養(yǎng)皿中，在37℃5%CO2條件下孵育一時間。
17在顯微鏡下評估胚胎質量，并與未冷凍時的胚胎形態(tài)進行對比。
18培養(yǎng)胚胎直至移植日為止。
解凍步驟：①從液氮罐中取出麥管，室溫中 40 秒（溫度上升 300 ℃ /min ） ,
用紙擦去麥管外面的冰；②麥管放入 30 ℃水中一分鐘，見溶液中冰已融化；③取下塑料棒，剪去塑料塞，使
F3 中胚胎流入 T1 放置 5 分鐘；④轉移胚胎到 T25 分鐘， T35 分鐘， T45
分鐘。這樣令冷凍保護劑 PROH 及 Sucrose 逐步脫掉；⑤在培養(yǎng)液中洗 2
次后，將放入培養(yǎng)液中，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 2 小時以后移植。
Seeding 常徒手操作，采用在液氮中浸泡過的鑷子頭迅速夾麥管中裝有胚胎的 F3
液段，誘發(fā)結冰。在 -7 ℃須停留 7-10 分鐘使全部液體結冰。
CL-8800型程序冷凍儀是當溫度降到-7℃時用液氮冷凍的鑷子植冰或用棉簽在程序降溫儀液氮浴桶內蘸少許液氮進行植冰。
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