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          生物知識(shí)

          ELISA檢測(cè)的影響因素的分析

          作者:admin 來(lái)源:本站 發(fā)布時(shí)間: 2010-12-03 10:09  瀏覽次數(shù):
          購(gòu)買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 m.kjhfd.cn

          ELISA即酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),是一種常用的固相酶免疫測(cè)定方法。Engvall 和Perlmann于1971年最先應(yīng)用該法進(jìn)行了IgG定量測(cè)定,并命名為“enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)”。 由于ELISA方法靈敏,特異性強(qiáng)不需要特殊設(shè)備,所以被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定[1]。如乙肝、丙肝抗體等等。但ELISA測(cè)定中影響因素較多,而且其操作中有一定的技術(shù)要求,在臨床檢驗(yàn)中除正常反應(yīng)外,有時(shí)??梢?jiàn)到一些錯(cuò)誤結(jié)果(即假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果)。本文就ELISA檢測(cè)的影響因素做如下討論。

            1  標(biāo)本的影響

            1.1  溶血標(biāo)本及混有紅細(xì)胞的血清采用ELISA法檢測(cè)易產(chǎn)生假陽(yáng)性  可能是溶血血清中含有過(guò)氧化酶物質(zhì)(紅細(xì)胞或血紅蛋白中的亞鐵血紅素),在洗滌過(guò)程中往往難以完全洗脫,它可使H2O2釋放出原生態(tài)氧(O),從而催化底物四甲基聯(lián)苯胺生成可溶性的有色物質(zhì),即顯藍(lán)色,產(chǎn)生假陽(yáng)性[2]。所以嚴(yán)重溶血標(biāo)本禁用。

            1.2  標(biāo)本受細(xì)菌污染 

            因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過(guò)氧化物酶,因此,被細(xì)菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣,亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測(cè)定結(jié)果。

            1.3  標(biāo)本保存不當(dāng) 

            在冰箱中保存過(guò)久的標(biāo)本,在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深、造成假陽(yáng)性;為克服上述干擾,ELISA測(cè)定的血清標(biāo)本宜為新鮮采集;如不能立即測(cè)定,5 d內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可存放于4℃,1周后測(cè)定的血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存;凍存后融解的標(biāo)本,蛋白質(zhì)局部濃縮,分布不均,應(yīng)充分混合后再測(cè)定,但混勻時(shí)應(yīng)輕柔,不可強(qiáng)烈振蕩。

            1.4  塑料試管能吸附抗原物質(zhì),樣本久置在塑料管內(nèi)會(huì)使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性  最好使用真空采血管;并使用非抗凝標(biāo)本,肝素抗凝血漿會(huì)增加OD值,EDTA、酶抑制劑(如NaN3)可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過(guò)氧化物酶活性。

            1.5  標(biāo)本凝固不全
           
            在工作中,有時(shí)為了爭(zhēng)取時(shí)間快速檢測(cè),常在血液還未開(kāi)始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清,使血清中仍殘留部分纖維蛋白原,在ELISA測(cè)定過(guò)程中可以形成肉眼可見(jiàn)的纖維蛋白塊,易造成假陽(yáng)性結(jié)果;因此血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清。

            2  試劑影響

              ELISA檢測(cè)試劑廠家較多;不同廠家出產(chǎn)的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別,使用質(zhì)劣的試劑必然導(dǎo)致結(jié)果的假陽(yáng)性或假陰性。因此,選擇高質(zhì)量的試劑是保證結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵之一。

            3  操作技術(shù)的影響

            3.1  吸量的準(zhǔn)確性 

            吸量不準(zhǔn)確,直接影響檢測(cè)結(jié)果。因此加樣器也要經(jīng)常清洗,定期校準(zhǔn)。

            3.2  溫浴影響 

            抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對(duì)溫度有嚴(yán)格要求,酶標(biāo)板周圍與內(nèi)部孔升降溫速率不同,造成周邊與內(nèi)部孔結(jié)果差異;干浴與水浴存在明顯的差異,盡可能使用水浴,并要求固相板放入水中,減少受熱不均,貼密封膜,防止污物浸入。

            3.3  加樣次序影響 

            有時(shí)我們?cè)诩訕舆^(guò)程中,常常會(huì)遇到個(gè)別標(biāo)本未離心等情況,為了節(jié)約時(shí)間,往往這時(shí)我們會(huì)先加酶結(jié)合物,然后等標(biāo)本分離好后再加標(biāo)本,這樣,竟常常會(huì)造成HBeAb和HBcAb的假陰性。因?yàn)镠BeAb和HBcAb都是競(jìng)爭(zhēng)抑制法,先加入酶標(biāo)記的抗體,首先與固相載體上的抗原結(jié)合,待加入顯色劑后,因酶的存在而顯色,故呈陰性[3]。

            3.4  洗滌方法對(duì)結(jié)果的影響 

            洗滌是ELISA操作的重要環(huán)節(jié),手洗條件一致性較差,對(duì)結(jié)果影響較大,全自動(dòng)洗板機(jī)使用不當(dāng)也會(huì)影響結(jié)果,血清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機(jī)針小孔處于阻塞狀態(tài),造成未結(jié)合標(biāo)記酶洗脫不徹底,導(dǎo)致“花板”造成假陽(yáng)性或假陰性;所以操作洗板機(jī)過(guò)程中要不時(shí)觀察洗板機(jī)針孔內(nèi)洗液的通暢狀況,洗板機(jī)不用時(shí)應(yīng)用去離子水清洗幾遍。

            4  干擾物質(zhì)的影響

              有人認(rèn)為大約40%的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì),可以不同程度影響檢測(cè)結(jié)果;常見(jiàn)的干擾物質(zhì)有:類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其他物質(zhì)等。如RF因子可與標(biāo)記二抗的FC段法結(jié)合造成假陽(yáng)性,高濃度的AFP(如孕婦),在儲(chǔ)存過(guò)程中可能形成二聚體會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深影響檢測(cè)結(jié)果。

              綜上所述,對(duì)臨床檢驗(yàn)ELISA測(cè)定中出現(xiàn)的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果,要從多方面進(jìn)行分析除試劑因素和操作因素之外,更多的應(yīng)從標(biāo)本因素方面進(jìn)行分析,并采取相應(yīng)措施排除干擾作用,從而為臨床提供正確可靠的檢測(cè)結(jié)果。

          【參考文獻(xiàn)】
             ?。?]宋炳榮,杜彩霞,崔娜,等. ELISA一步法檢測(cè)乙型肝炎病毒標(biāo)志物影響因素的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 實(shí)用醫(yī)技雜志,2004,9(11):65.

            [2]吳大富,楊紅梅,李臘梅. 血細(xì)胞及溶血對(duì)EIA一步檢測(cè)乙型肝炎兩對(duì)半的影響[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)進(jìn)修雜志,2002,30(2):122.

           ?。?]李天星.現(xiàn)代臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)[M].北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社,2001:57.

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