http://m.kjhfd.cn/plus/list.php?tid=79
引言 HIV抗體初篩實(shí)驗(yàn)最常見方法是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),實(shí)驗(yàn)中許多因素使結(jié)果產(chǎn)生不確定性,現(xiàn)作如下探討。
1 一般資料 2001/2007入伍新兵26600名血清標(biāo)本進(jìn)行HIV抗體測(cè)定,常規(guī)抽取靜脈血,低速離心分離血清,在2h內(nèi)嚴(yán)格按照說明書完成測(cè)定。酶標(biāo)儀為DENLEY DRAGON WE Scan MK2型自動(dòng)酶標(biāo)儀,洗板機(jī)為Stat fax-2600型洗板機(jī),移液器為eppendorf電子可調(diào)移液器,試劑盒由北京金豪制藥有限公司生產(chǎn); 臨界值設(shè)定為cutoff值=0.1+N( 陰性對(duì)照平均值)。標(biāo)本A值小于cutoff值為陰性,大于或等于cutoff值為陽(yáng)性;陰性對(duì)照A值小于0.02時(shí),按0.02計(jì)算;陽(yáng)性對(duì)照A值小于0.5,陰性對(duì)照A值大于0.1,實(shí)驗(yàn)不成立。 結(jié)果全部標(biāo)本HIV抗體陰性。標(biāo)本溶血,加樣快慢,孵育顯色時(shí)間,采用單、雙波長(zhǎng)測(cè)定,洗滌液濃度等均對(duì)ELISA測(cè)定HIV抗體有較大影響。
2 討論
2.1 標(biāo)本采集與保存 ①避免溶血:血紅蛋白含有血紅素基團(tuán),有類似過氧化物作用,以辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的ELISA實(shí)驗(yàn)中,血清標(biāo)本中血紅蛋白與HRP反應(yīng)顯色出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果;②冰凍保存血清樣本須避免反復(fù)凍融:反復(fù)凍融標(biāo)本所產(chǎn)生機(jī)械剪切力對(duì)蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用,從而產(chǎn)生假陰性結(jié)果[1];③待血液標(biāo)本完全凝固方可加樣,否則因反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留紅細(xì)胞出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
2.2 試劑準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)前將試劑從冰箱取出,室溫放置20min以上以與室溫平衡,使反應(yīng)微孔內(nèi)溫度較快達(dá)到37℃,防止弱陽(yáng)性樣本出現(xiàn)假陰性。
2.3 加樣與試劑 垂直加樣(試劑)不可太快,以防止濺出和產(chǎn)生氣泡,若加樣過快,難以保證加樣量的準(zhǔn)確性。非垂直加樣易加在微孔非包被區(qū),致非特異性吸附。加樣過猛易使樣本(試劑)濺出對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染,產(chǎn)生氣泡使液面差異致酶標(biāo)儀測(cè)定出現(xiàn)誤差。為確保加入試劑的準(zhǔn)確性,應(yīng)使用精密移液器,不可使用滴瓶滴加。
2.4 孵育 孵育是決定ELISA測(cè)定成敗關(guān)鍵環(huán)節(jié),所需時(shí)間與溫度成反比,最常用的孵育溫度為37℃,30min。①反應(yīng)時(shí)間:通常在加樣(試劑)后,將微孔放入水浴箱時(shí),孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃需一定時(shí)間,尤其在室溫較低及非水浴狀態(tài)下,升溫時(shí)間會(huì)較長(zhǎng);如將微孔從放入水浴箱開始計(jì)時(shí),使實(shí)際水育時(shí)間不夠,導(dǎo)致弱陽(yáng)性標(biāo)本漏檢。為保證設(shè)定溫度下有足夠孵育時(shí)間,可依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室不同環(huán)境溫度下微孔板從室溫至孵育箱后達(dá)設(shè)定溫度需要時(shí)間長(zhǎng)短確定在孵育箱中孵育時(shí)間;②孵育溫度:國(guó)產(chǎn)HIV抗體初篩ELISA試劑一般為37℃,30min;進(jìn)口試劑可有37℃,1h;從抗原抗體反應(yīng)本質(zhì)來說,在較低溫度下,反應(yīng)較長(zhǎng)時(shí)間最佳。在較高反應(yīng)溫度下,由于分子運(yùn)動(dòng),反應(yīng)時(shí)間縮短,對(duì)強(qiáng)陽(yáng)性樣本測(cè)定無影響,但對(duì)分子含量較少的弱陽(yáng)性樣本則有漏檢可能;③“邊緣效應(yīng)”:產(chǎn)生邊緣效應(yīng)的原因可能與微孔板周孔與中心孔、孔周與孔中心表面熱力學(xué)特征不同有關(guān),研究證實(shí)熱力學(xué)梯度是造成“邊緣效應(yīng)”的根本原因[2]。建議盡量使用水浴或?qū)⒎磻?yīng)溶液與微孔板先加熱至設(shè)定溫度,即可避免“邊緣效應(yīng)”。
2.5 洗滌 ①固相免疫測(cè)定技術(shù)是一種非均相測(cè)定技術(shù):需要洗滌將反應(yīng)過程中非特異性吸附成份洗滌,以確認(rèn)抗原抗體特異性結(jié)合;常用HIV抗體ELISA初篩試劑盒均以HRP(HRP)作為標(biāo)記物的洗滌液,一般為含0.005g/L Tween20中性PBS,Tween20濃度不可過高,超過0.02g/L可使包被于固相上的抗原解吸附而影響實(shí)驗(yàn)測(cè)定下限;為防止洗板機(jī)洗滌后有液體殘留,建議洗完后在吸水紙上拍干;②按要求次數(shù)洗滌。洗滌次數(shù)過少會(huì)因酶殘留導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果(花板)[3],洗滌次數(shù)過多會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。
2.6 顯色 常用HIV抗體ELISA試劑盒多以HRP為標(biāo)記酶,以四甲基鄰苯胺(TMB)為底物。從理論上講,在37℃,30min才可使底物催化完全,在最初10min內(nèi)絕大部分催化反應(yīng)即可完成。雖然試劑盒要求放置10min,為使弱陽(yáng)性樣本有充分顯色,建議在37℃反應(yīng)20-30min后終止反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定為好。
2.7 雙波長(zhǎng)測(cè)定 ELISA測(cè)定中空白孔非特異性吸附具有不確定性,故測(cè)定時(shí)最好使用雙波長(zhǎng)。
2.8 空白設(shè)定 一般試劑盒均要求設(shè)空白,但我們?cè)趯?shí)際操作中發(fā)現(xiàn),如使用雙波長(zhǎng)測(cè)定無需設(shè)空白,在使用單波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)可設(shè)空白,并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如使用雙波長(zhǎng)測(cè)定并設(shè)空白可能會(huì)造成陰性孔吸光度值為負(fù)數(shù)現(xiàn)象,使結(jié)果判讀難以解釋。
【參考文獻(xiàn)】
[1]赫啟昌,賀霞,杜曉靜,等。HIV抗體檢測(cè)弱陽(yáng)性結(jié)果分析[J]。中國(guó)公共衛(wèi)生,2006,6:696。
[2]季陽(yáng),賈桂芹,張永剛。HIV抗體篩查與確證[J]。中國(guó)輸血雜志,1994,4:179-181。
[3]于振喜,李連潔。用HIV法檢測(cè)HIV抗體時(shí)如何避免“花板”?[J]。中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2006,23:56。
Editor:李軍民等