關 舒 胡新旭 馬秋剛 王 寧 計 成
摘 要 黃曲霉毒素B1具有高毒性、高致畸性和高致突變性，是危害最大的真菌毒素之一。黃曲霉毒素污染嚴重威脅動物的生產(chǎn)性能和人類健康，每年給飼料工業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失。對黃曲霉毒素污染的控制急需一種安全、高效而且環(huán)保的解毒方法。文章對傳統(tǒng)去毒方法和新型生物技術降解黃曲霉毒素的研究進行了綜述。
關鍵詞 黃曲霉毒素；解毒；生物技術
中圖分類號 S816.33
Aflatoxin detoxification by traditional methods and biological technology
Guan Shu, Hu Xinxu, Ma Qiugang, Wang Ning, Ji Cheng
Abstract Aflatoxin B1(AFB1), one of the most hazardous mycotoxins, is extremely toxic, mutagenic and carcinogenic. It poses severe threat to both livestock productivity and human health and thus, brings huge worldwide economic losses each year. A safe, effective and environmentally sound detoxification method is urgently needed for controlling this toxin. Researches on aflatoxin detoxification by traditional methods, as well as biological strategies are reviewed in this study.
Key words aflatoxin；detoxification；biological technology
1 黃曲霉毒素的危害
黃曲霉毒素是一類主要由黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，具有極強的毒性。其中，黃曲霉毒素B1(AFB1) 毒性最強，具有致癌、致畸和引起肝臟損傷的作用（Guengerich等，1996）。
AFB1廣泛存在于飼料原料中,如花生粉、豆粕、棉籽粕、玉米、高粱等。到目前為止,黃曲霉毒素仍是對畜牧業(yè)威脅最大的霉菌毒素之一,各種動物對黃曲霉毒素均具有很高的敏感性。Madden等(1999)報道,日糧中含0.2 mg/kg黃曲霉毒素即可引起家禽采食量和增重降低,降低程度與黃曲霉毒素濃度有關。AFB1可引起雞細胞免疫抑制,外周血液中T淋巴細胞數(shù)量減少,白細胞和球蛋白值降低,生產(chǎn)性能和免疫功能下降。Prasad(2002)研究了AFB1對家禽的影響發(fā)現(xiàn),單一劑量AFB1的平均半致死量(LD50)(mg/kg體重)雞6.5~16.5、鴨0.34，鴨比雞更敏感,特別是雛鴨。對于生長禽日糧中的AFB1的安全值,一般認為不應超過20 μg/kg。豬對AFB1也很敏感，尤其是哺乳母豬和仔豬。母豬采食受AFB1嚴重污染的飼料,母乳中會出現(xiàn)高水平的AFB1,進而對哺乳仔豬產(chǎn)生影響。研究表明,日糧中AFB1濃度為20～200 μg/kg可引起母豬采食量和生產(chǎn)性能下降,1 000～5 000 μg/kg時可致中毒。家畜對黃曲霉毒素的易感性其順序是:小鴨>雞>小豬>犢牛>肥育豬>成年牛>綿羊。有研究發(fā)現(xiàn)，通過食物鏈進入人體的黃曲霉毒素具有極強的致癌作用,嚴重威脅人類健康。
2 黃曲霉毒素常規(guī)去毒方法
2.1 堿處理法
堿處理法包括氨化法和氫氧化鈉法。Mukendi 等（1991）報道了使用亞硫酸鈉、硫酸氫鈉、氫氧化鈉、氨等化學試劑對黃曲霉毒素去毒的研究,并分析了影響這些化合物去毒效果的各種因素。Natarajan等(1992)研究了氯化劑、堿類(氨、甲氨、氫氧化鈣)以及醛類(甲醛)對黃曲霉毒素污染的花生粉的去毒作用,并研究了這些化學試劑對花生粉的理化性質(zhì)的影響。堿處理法適合應用于含水量較高的青綠、青貯飼料以及液態(tài)糧油，去毒效率高，但不適合籽實、餅粕等大部分固體飼料原料，而且處理后原料殘留有大量氨。由于該方法使用的設備投資大，成本高，已逐漸被淘汰。
2.2 氧化處理法
常用氧化試劑有次氯酸鈉、臭氧、過氧化氫、氯氣等。Patel等（1989）報道,若同時使用過氧化氫和γ-射線照射則可以更有效地降低黃曲霉毒素的毒性，如4 000 Gy的γ-射線和5%過氧化氫可使100 pg的黃曲霉毒素完全滅活。此外紫外光照射法也是利用紫外線的強氧化作用去毒。但是該方法主要問題在于處理效果不穩(wěn)定，飼料中維生素等營養(yǎng)成分損失嚴重，處理成本較高(Rustom，1997；Albores等，2005)。
2.3 吸附劑脫毒
常用吸附劑包括酵母細胞壁、硅鋁酸鹽、活性炭等。國外有報道稱以硅藻土作吸附劑除去花生油中的黃曲霉毒素比較有效。Phillips等(1995)報道了使用偶聯(lián)有化學配基的硅藻土選擇性吸附黃曲霉毒素并進一步進行化學解毒的方法,效果良好。但是使用吸附劑不能解除黃曲霉毒素的毒性，它可能同時吸附飼料中的營養(yǎng)成分而降低營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，而且被吸附的毒素有可能在動物胃腸道中重新釋放。飼料行業(yè)目前采用這種方法較多，也有許多新型的吸附劑問世,但其應用效果還有待考察。
2.4 抗氧化劑
Hayes等（1992）報道，含化學抗氧化劑的飼料能增強大鼠抗AFB1的能力,這類抗氧化劑包括2-叔丁基對甲酚(BHA)、2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)、異硫氰酸芐酯、2,2,4-三甲基-6-乙氧喹啉等。其機理是抗氧化劑能促進大鼠體內(nèi)α-谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-YC2亞基的表達,有效地抑制了AFB1與機體DNA的結合。但是抗氧化劑的去毒作用有限，不能完全消除黃曲霉毒素中毒癥，而且BHT等抗氧化劑濃度均超過常規(guī)使用量的30倍以上才顯示較好的去毒效果，這樣對動物具有一定毒害作用(Fanelli等，2003)。
2.5 高溫處理法
高溫處理法包括高溫烘烤、蒸煮或日光照射等。破壞AFB1需268 ℃以上的溫度，能耗高且對飼料中的營養(yǎng)成分破壞大，實際應用很少(Hassan等，2005；Yazdanpanah等，2005；Gowda等，2007)。
2.6 合格原料稀釋法
這種方法雖然能夠有效減輕動物中毒癥狀和生產(chǎn)性能抑制，但有可能造成毒素污染范圍的擴大。
目前有很多描述物理和化學方法去除黃曲霉毒素的報道。但是以上每種方法都存在一些問題，如導致飼料中的營養(yǎng)損失，影響飼料的感官品質(zhì)，有些方法所需要的設備價格昂貴等等，從而限制了其在實際生產(chǎn)中的應用（Piva 等，1995）。
3 黃曲霉毒素生物降解
Bata等(1999)提出有效的霉菌毒素去毒方法應該滿足以下幾點要求：毒素應該被破壞或者被轉(zhuǎn)化成無毒化合物；真菌孢子和菌絲體應被破壞,這樣就不會有新的毒素產(chǎn)生；飼料應該保持它原有的營養(yǎng)水平和風味；原料的物理性狀不應被明顯改變；去毒加工應該經(jīng)濟可行。
利用微生物或其代謝產(chǎn)物進行解毒具備高效率、特異性強，以及對飼料和環(huán)境沒有污染的優(yōu)勢，代表了生物解毒的新方向。研究發(fā)現(xiàn)，生物酶解毒具有對飼料無污染、有高度的專一性,不影響飼料的營養(yǎng)價值,而且能夠避免毒素的重新產(chǎn)生等優(yōu)點(Mishra等,2003)。于是近些年生物酶解毒法成了研究的熱點。
3.1 微生物吸附黃曲霉毒素
許多微生物，包括細菌、放線菌、酵母菌、霉菌菌絲體都能吸附真菌毒素。乳酸菌屬的許多菌株，包括Lactobacillus（El-Nezami等,1998；Gratz等，2005）、Bifidobacterium(Peltonen等,2000；2001)、Propionibacterium(El-Nezami等,2000)和Lactococcus(Pierides等，2000)等都被報道具有吸附黃曲霉毒素的作用。朱新貴等(2001)報道了乳酸菌、醋酸菌、面包酵母菌、釀酒酵母菌、米曲霉和枯草芽孢桿菌均對黃曲霉毒素有去除作用，但由于是用帶有活菌的發(fā)酵液進行實驗，所以其作用機制很可能是菌體的吸附作用。在以上這些微生物去毒的過程中，活菌細胞的存在是必要條件。但是以上很多試驗都證實，這種吸附作用是可逆的，毒素分子并沒有消失，隨著培養(yǎng)時間的延長，部分毒素會重新釋放到培養(yǎng)基質(zhì)中。所以，微生物吸附去毒并不是很理想的解毒方法。
3.2 微生物代謝產(chǎn)物降解黃曲霉毒素
近年來，有越來越多的研究報道了微生物或其代謝產(chǎn)物降解黃曲霉毒素。根據(jù)解毒菌的種類，大致劃分為真菌和細菌。
3.2.1 真菌及其代謝產(chǎn)物降解黃曲霉毒素
早在20世紀70年代末，Doyle等(1979)就發(fā)現(xiàn)了寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)能夠產(chǎn)生降解AFB1的過氧化物酶,并報道過氧化物酶的量與AFB1被降解的量之間存在著直接的關系。 之后Huynh等(1984)報道，黑曲霉(Aspergillus niger)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、綠色木霉(Trichoderm viride)、毛霉菌(Mucor ambiguous)以及少數(shù)其它真菌對AFB1也有很好的降解能力，但其中的一些菌株在條件改變的情況下有可能產(chǎn)生AFB1。Marisa等(2003)從白腐真菌和褐腐真菌的代謝產(chǎn)物中分離出了胞外解毒酶，研究了該酶解毒反應的最佳pH值和溫度,并將其純化。近年來,很多研究發(fā)現(xiàn)真菌的代謝產(chǎn)物能夠降解黃曲霉毒素,這些真菌包括 Trametes versicolor(Zjalic等，2006)、Rhizopus sp., Mucor sp.(Varga 等,2005)以及一些酵母菌,包括Trichosporon mycotoxinivorans(Molnar等,2004)、Saccharomyces cerevisiae(Shetty等，2006)和Trichoderma屬的菌株(Shantha等，1999)。
國內(nèi)劉大嶺研究小組開展了比較多的工作，并取得了顯著成果。他們發(fā)現(xiàn)從假密環(huán)菌(Armillariella tabescens)中提取的粗酶液可使樣品中的AFB1含量減少80%?；钚晕镔|(zhì)解毒作用的溫度、pH值、時間等特征表明, 粗酶液中起解毒作用的可能是某種酶。隨后，他們從該真菌的菌絲提取物中分離出一種可以脫除黃曲霉毒素毒性的解毒酶，克隆得到其基因序列,成功轉(zhuǎn)化到畢赤酵母表達系統(tǒng)中，并對該酶的固定化技術進行了研究。然而以上解毒酶的理想反應條件都是中性pH值、高水分的體外反應體系，適合植物油、醬油、啤酒、牛奶等，難以在籽實、餅粕等低水分飼料原料中直接應用 (劉大嶺等,1995；Liu等，1998、2001)。陳儀本等(1998)研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉(Aspergillus niger)菌絲體提取物能夠降解花生油中的黃曲霉毒素。這種活性物質(zhì)的解毒作用效率高，且通過溫度、水分、時間等對其解毒反應的試驗表明，降解過程是酶促反應。考慮到酶促反應必須在水的存在下發(fā)生反應，該研究小組選擇了谷殼培養(yǎng)法將解毒酶固定化，從而解決了酶制劑在含水量低的環(huán)境下難以作用的難題。
上述真菌的解毒作用絕大部分源于細胞內(nèi)提取物，由于操作過程需要破碎真菌細胞或菌絲體，程序繁瑣，限制了實際應用。
3.2.2 細菌及其代謝產(chǎn)物降解黃曲霉毒素
細菌及代謝產(chǎn)物降解黃曲霉毒素的報道并不多。目前已有的報道均顯示,解毒作用源于胞外代謝產(chǎn)物。
Ciegler等（1996）曾報道，Nocardia corynebacterioides和Mycobacterium fluoranthenivorans菌均可以有效的降解AFB1。Line等（1994）使用14C標記AFB1與橙色黃桿菌(F. aurantiacum)反應并對放射性物質(zhì)進行追蹤和檢測，研究發(fā)現(xiàn)，無論活細胞還是死細胞均能夠降低AFB1含量，但活細胞的作用遠大于死細胞，并且只有活細胞釋放了被標記了的CO2，這表明一定量的AFB1被菌體細胞所代謝。這種方法也為研究AFB1在動物體內(nèi)的代謝途徑提供了參考。此外, 他們還發(fā)現(xiàn)從橙色黃桿菌提取的粗蛋白物質(zhì)在水溶液中可以降解74.1%的AFB1，而用熱處理失活的粗蛋白只能降解5.5%的AFB1。用脫氧核糖核酸酶I處理粗蛋白后發(fā)現(xiàn)可以降解80.5% 的AFB1，而蛋白酶K處理后降解率降低到34.5%，這表明橙色黃桿菌對黃曲霉毒素的解毒作用可能是酶促反應。Smiley等(2000)也發(fā)現(xiàn)一株橙色黃桿菌(F. aurantiacum)的粗蛋白提取物在水溶液中可以降解AFB1，并推測是酶促反應。
Teniola等(2005)報道了4株具有降解AFB1活性的菌。其中，紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)和Mycobacterium fluoranthenivorans菌的胞外提取物在30 ℃分別與AFB1反應4 h后，降解率都在90％以上，8 h后基本檢測不到AFB1殘留。胞外提取物在熱處理和蛋白酶K處理后解毒效率大大降低，從而推斷解毒過程是酶促反應。該研究小組還對紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)解毒酶的特性進行了研究(Alberts等，2006)。
以飼料、土壤、動物糞便和植物腐殖質(zhì)等65個樣品為基質(zhì),廣泛篩菌并獲得25株具有降解黃曲霉毒素作用的細菌純培養(yǎng)物。其中源自南美貘糞便的一株細菌[鑒定為嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)]具有很強的解毒能力，其胞外代謝產(chǎn)物在72 h 內(nèi)能降解78.7% 的黃曲霉毒素，而活菌細胞和胞內(nèi)提取物均無解毒活性；蛋白酶K 和熱處理后的提取物解毒能力消失，并且解毒反應受溫度、pH值和金屬離子的影響，從而推測起解毒作用的物質(zhì)很可能是酶（Guan等，2008）。對該解毒酶的層析和蛋白質(zhì)電泳研究表明，起解毒作用的酶至少有三種，為混合酶。進一步的研究將對解毒酶加以純化，并試圖尋找解毒酶基因，通過分子生物學技術進行高效表達。
4 結語
經(jīng)研究表明，黃曲霉毒素可以通過生物酶降解作用得以去除。在溫和的條件下生物酶的解毒不會產(chǎn)生其它有毒的化學物質(zhì)，也不會損失或極少的損失飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)。雖然黃曲霉毒素的生物降解研究已經(jīng)有了很大進展，但是由于酶作用條件苛刻等原因，離實際生產(chǎn)應用還有一定距離。目前，在國內(nèi)外使用生物學方法降解黃曲霉毒素在飼料工業(yè)中的應用剛剛起步。應用生物學方法降解黃曲霉毒素的技術關鍵在于篩選出能產(chǎn)高活性解毒酶的菌株，并在飼料中創(chuàng)造一個有利于酶促反應的含水微環(huán)境。因此，篩選出高效產(chǎn)酶菌株，通過酶工程、基因工程等手段獲得解毒作用條件寬的解毒酶是今后研究的方向。
（參考文獻44篇，刊略，需者可函索）
（編輯：沈桂宇，guiyush@126.com）
關舒,中國農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，100193，北京市海淀區(qū)圓明園西路2號。
胡新旭、馬秋剛、王寧、計成(通訊作者)，單位及通訊地址同第一作者。
收稿日期：2008-11-03
★ 國家自然科學基金（30571353）
