中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志 2000年第5期第20卷 細(xì)菌學(xué)
作者：芮勇宇 俞守義 王紅 蔡初的 蕭斌權(quán) 李建基 廖育煌 鐘豪杰 羅不凡
單位：芮勇宇 俞守義 王紅（510515廣州，第一軍醫(yī)大學(xué)流行病學(xué)教研室）；蔡初的 蕭斌權(quán) 李建基 廖育煌 鐘豪杰 羅不凡（廣州市衛(wèi)生防疫站）
建立PCR-RFLP-SSCP及測序方法，用于分析霍亂弧菌腸毒素AB(ctx-AB)基因多態(tài)性。針對ctx-AB基因設(shè)計引物，擴(kuò)增片段為528bp，包括ctx-B編碼基因375bp，引物序列為5′-GGT GTA AAA TTC CTT GAC G-3′和5′-GGT TCG ATG ATG AGA AGC-3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)RsaⅠ酶切為317bp和211bp 2個片段。對酶切產(chǎn)物進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析，銀染色法顯示結(jié)果。對不同SSCP類型測序，利用PCR方法直接對PCR產(chǎn)物測序。
霍亂弧菌O1群古典型(CVC)標(biāo)準(zhǔn)株569B和16017，埃爾托型(EVC)標(biāo)準(zhǔn)株919，O139群標(biāo)準(zhǔn)株MO45，EVC80株(廣東省90年代病人分離株)，O139群10株(廣東省90年代病人分離株)，由廣東省和廣州市衛(wèi)生防疫站提供。PCR擴(kuò)增ctx-AB基因，上述菌株均產(chǎn)生1條約528bp的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)RsaⅠ內(nèi)切酶消化后，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，均可見1條約317bp的片段和1條約211bp的片段。酶切產(chǎn)物經(jīng)SSCP分析，分為A和B兩個類型，CVC、EVC和O139群標(biāo)準(zhǔn)株均為A型，80株EVC(廣東省分離株)中8株為A型，其余為B型；O139群(廣東省分離株)均為A型。進(jìn)一步測序表明兩類型基因序列有3個位點不同，以ctx-B基因的起始堿基定位為1，其下游序列為正，上游序列為負(fù)，兩類型在103、115和203位點堿基不同，A型為A、C和C(相應(yīng)位點編碼的氨基酸為Asp、Tyr和Ile)，B型為G、T和T(相應(yīng)位點編碼的氨基酸為Asn、His和Thr)。與基因庫中霍亂弧菌的ctx-AB基因序列比較，B型103位點與國外報道的序列均不同，可能為廣東地區(qū)菌株特有的突變。PCR-RFLP-SSCP及測序方法快速、簡便、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)，適用于對大量標(biāo)本某重要基因多態(tài)性的研究。
(收稿日期：1999-11-17) |
