生理學(xué)報(bào) 2001年第4期第53卷
1第四軍醫(yī)大學(xué)生理學(xué)教研室；西安 710032；2中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所；上海 200031
郭海濤1；朱妙章1；*；呂順艷1；于軍1；董明清1；高瞻1；施溥濤2
關(guān)鍵詞：血管鈉肽；低氧；心成纖維細(xì)胞；Ca2+
摘要：為了觀察血管鈉肽(vasonatrin peptide, VNP)對(duì)低氧作用時(shí)心成纖維細(xì)胞增殖的影響, 將分離純化乳鼠心成纖維細(xì)胞, 隨機(jī)分為4組:對(duì)照組、 低氧組(2%～3%)、 VNP組(10－８～10－６ mol/L)和VNP+低氧組。用MTT比色法、 ~3H-TdR摻入法觀察細(xì)胞增殖情況,采用激光共聚焦方法研究VNP對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度(［Ca2+］i)水平的影響。旨在探討VNP對(duì)低氧刺激心成纖維細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn),低氧可以使培養(yǎng)的乳鼠心成纖維細(xì)胞MTT光吸收值(OD值)較對(duì)照組顯著增高(P＜0.05)。VNP (10－６ mol/L)可以顯著降低低氧刺激的心成纖維細(xì)胞MTT oD值和細(xì)胞內(nèi) ~3H-TdR摻入量的增高(P＜0.05)。對(duì)照組［Ca2+］i水平無(wú)顯著差異, 低氧組［Ca2+］i水平顯著升高, 而VNP (10－６ mol/L)能使升高的［Ca2+］i水平較對(duì)照組、 低氧組顯著降低(P＜0.05)。結(jié)果表明, VNP能減弱低氧對(duì)心成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的刺激作用,其機(jī)制可能與Ca2+等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子有關(guān)。低氧性心肌肥厚是高原性心臟病的主要表現(xiàn)之一,是低氧性肺動(dòng)脈高壓向心力衰竭發(fā)展的一個(gè)病理過(guò)程［1］。其形成過(guò)程與心臟負(fù)荷以及內(nèi)皮素(ET-1)、血管緊張素Ⅱ (AngⅡ)、生長(zhǎng)因子等眾多的因素有關(guān)［2～6］。低氧導(dǎo)致的交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng), 心肌細(xì)胞及心成纖維細(xì)胞自分泌、 旁分泌增強(qiáng)， 各種體液因素促進(jìn)心成纖維細(xì)胞分裂增殖、分泌膠原及其它間質(zhì)成分, 是低氧性心肌肥厚形成的可能機(jī)制之一［3～6］。降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)有抑制低氧致肥大的效應(yīng)［7,8］。血管鈉肽(vasonatrin peptide, VNP)是一種由27個(gè)氨基酸殘基組成的人工合成多肽,是ANP和C型利鈉尿肽(CNP)的嵌合體, 與ANP和CNP有高度的結(jié)構(gòu)同源性, 因此, 可能有相似的藥理效應(yīng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明VNP可以降低肺動(dòng)脈高壓大鼠的右心室重量(反映右心室肥厚的指標(biāo))［9,10］,這可能是降低右心室后負(fù)荷的結(jié)果, 但是否有直接抑制心成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的作用, 目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道很少。因此, 本實(shí)驗(yàn)的主要目的是觀察VNP對(duì)低氧刺激的心成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其可能的機(jī)制。
1材料和方法
1.1 材料 SD乳鼠(1～2 d): 由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供, 胰酶由DIFCO公司生產(chǎn), 膠原酶、 EDTA、 DMEM培養(yǎng)基、 小牛血清為GIBCO公司產(chǎn)品, vNP由中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所提供, 3HTdR由中國(guó)科學(xué)院上海核技術(shù)開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn), Brdu為Sigma公司產(chǎn)品, MTT為西安華美試劑公司生產(chǎn),酶聯(lián)免疫分析儀和LS6500液體閃爍計(jì)數(shù)器為美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品, 1H21A型Expired gas monitor為日本3A公司產(chǎn)品。
1.2 方法
1.2.1 主要藥物配制VNP: 用生理鹽水配成10－３ mol/L的原液, 4℃保存, 實(shí)驗(yàn)前用DMEM培養(yǎng)基稀釋成工作液。DMEM培養(yǎng)基: 按說(shuō)明書配制,用0.1 mol/L的鹽酸調(diào)pH至7.2～7.4, 4℃保存?zhèn)溆?。小牛血? 56℃滅活30 min, －20℃保存。胰蛋白酶: 用生理鹽水配成2.5 g/L的溶液, 4℃保存?zhèn)溆?。EDTA: 用生理鹽水配成0.4 g/L的溶液, 4℃保存?zhèn)溆谩Ｄz原酶: 用生理鹽水配成1.5 g/L的溶液,4℃保存?zhèn)溆?。MTT溶液:用生理鹽水配制, 使用濃度為5 g/L, 用0.22 μm微孔濾器過(guò)濾除菌后分裝, 4℃保存。2周內(nèi)有效。閃爍液: PPO 2.5 g, POPOP 0.25 g溶于500 ml二甲苯中, 搖2～3 次/日, 3～5 d后使用。避光保存。
1.2.2 心成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于無(wú)菌條件下取出乳鼠的心臟, 剪碎, 以1.25 g/L胰蛋白酶及0.75 g/L的膠原酶消化成單細(xì)胞懸液, 離心(1*#000 r/min, 5 min), 用含0.1 mmol/L BrdU及100 ml/L滅活小牛血清的DMEM培養(yǎng)基重新懸浮, 貼壁90 min后將懸浮細(xì)胞吸棄,加入含100 ml/L滅活小牛血清的DMEM培養(yǎng)基傳代至2～4代時(shí), 將心成纖維細(xì)胞以5×107/L接種于96孔培養(yǎng)板(用于MTT比色或測(cè)~3H-TdR)或100 ml的玻璃培養(yǎng)瓶(用于傳代), 之后, 移入37℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。若細(xì)胞貼壁并已伸展但未匯合 (subconfluent),用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢查活細(xì)胞數(shù)超過(guò)95%, 可供以后實(shí)驗(yàn)用。
1.2.3 心成纖維細(xì)胞的鑒定在倒置顯微鏡下觀察, 細(xì)胞呈梭形、 多角形, 細(xì)胞質(zhì)透明, 細(xì)胞核明顯變大, 呈橢圓形, 常含有2～3個(gè)核。用SABC法免疫組織化學(xué)染色,將心成纖維細(xì)胞以5×107/L接種于24孔培養(yǎng)板(預(yù)置于10 mm×10 mm蓋玻片上), 待細(xì)胞爬片至接近融合時(shí), 將24孔培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞以40 g/L的多聚甲醛固定(4℃、 20 min), 然后以15 g/L的正常羊血清孵育30 min, 以封閉組織中的抗體非特異性結(jié)合位點(diǎn)。將2 g/L BSA/0.5 g/L NaN3/PBS稀釋的Ⅰ抗體 (分別為動(dòng)物抗人FN、 抗波形蛋白、 抗血管平滑肌肌動(dòng)蛋白) 加至玻片上, 4℃孵育48 h, 再依次在生物素化抗IgG(1∶400)和ABC液(1∶200)中分別孵育2.5 h (25℃)。最后用硫酸鎳銨葡萄糖氧化酶法呈色, 蘇木素復(fù)染, 經(jīng)脫水透明后封片。
1.2.3 細(xì)胞低氧培養(yǎng)方法將接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板的細(xì)胞放置于一體積約7 L的真空干燥瓶中, 通入95% N2和5% CO2的混合氣體, 以2 L/min,通氣12 min, 使真空干燥瓶中氣體濃度達(dá)到2%～3% O2和5% CO2。用Expired gas monitor分別檢測(cè)真空干燥瓶中0, 6、 12、24、 48 h的氣體濃度。在0～24 h， 氣體濃度可維持在2%～3% O2和5% CO2。
1.2.4 MTT比色法將心成纖維細(xì)胞以5×107/L 每孔100 μl接種至96孔板, 將不同培養(yǎng)板隨機(jī)分為兩組, 同一培養(yǎng)板又按豎排隨機(jī)分為4組: 對(duì)照組、 vNP組(10－８～10－６ mol/L)及低氧組(2%～3%)、 以及VNP (10－８～10－６ mol/L)+低氧組。24 h后換為各種濃度的藥物,置于低氧或常氧環(huán)境24 h, 以5 g/L, 每孔20 μl加入MTT。4 h后吸棄液體, 以每孔150 μl加入DMSO, 輕輕震蕩10 min,用酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)光吸收值。
1.2.5 ~3H-TdR取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞將心成纖維細(xì)胞以5×１０７/L 每孔100 μl種至96孔板。 將不同培養(yǎng)板隨機(jī)分為兩組,同一培養(yǎng)板又按豎排隨機(jī)分為5組: 對(duì)照組、 VNP組(10－８～10－６ mol/L)、 2.5×10－4 mol/L維拉帕米組及低氧組(20～30 ml/L)、 VNP (10－８～10－６ mol/L)+低氧組、 2.5×10－4 mol/L維拉帕米+低氧組。24 h后換為各種濃度的藥物,每孔加入11.1 kBq ~3H-TdR, 置于低氧或常氧24 h, 多頭細(xì)胞收集器收集細(xì)胞至玻璃纖維濾紙上, 烤干。將玻璃纖維濾紙置于閃爍計(jì)數(shù)管中,每管加入閃爍液0.5 ml, 用液態(tài)閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定放射性。
1.2.6 細(xì)胞內(nèi)Ca2+的測(cè)定將心成纖維細(xì)胞以１０7/L, 每皿0.3 ml接種至中心有孔的培養(yǎng)皿上(培養(yǎng)皿底部中心鉆直徑為1.5 cm的孔, 將20 mm×20 mm蓋玻片用中性樹(shù)膠粘在培養(yǎng)皿底部)。待細(xì)胞貼壁后, 用臺(tái)氏液洗滌細(xì)胞2次, 于37℃避光條件下用fluo-3/AM (10 μmol/L)荷載,50 min后用臺(tái)氏液洗滌3次, 洗去殘余染料。用共聚焦顯微鏡動(dòng)態(tài)掃描細(xì)胞內(nèi)鈣的熒光強(qiáng)度變化。
1.2.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以mean±SD表示, 兩組均數(shù)采用t檢驗(yàn), 多組間均數(shù)采用Origin5.0軟件中單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P＜0.05為相差顯著, P＜0.01為相差非常顯著, P＞0.05無(wú)顯著差異。
2結(jié)果
2.1 VNP對(duì)低氧刺激的心成纖維細(xì)胞MTT OD值的影響
培養(yǎng)板在常氧時(shí)心成纖維細(xì)胞受不同濃度VNP作用后, MTT OD值與對(duì)照組無(wú)明顯差異。放入低氧環(huán)境后, 低氧可以使心成纖維細(xì)胞MTT oD值增加。對(duì)照組OD值為0.30±0.02, 當(dāng)放入低氧環(huán)境中OD值為0.35±0.04, 較對(duì)照組增加17%(P＜0.05)。VNP可以降低低氧刺激的心成纖維細(xì)胞OD 值。 當(dāng)?shù)蜅l見(jiàn)下加入 10－7 mol/L VNP 時(shí), OD 值為0.31±0.03,較低氧組降低11% (P＜0.05); 加入10－６ mol/L VNP時(shí), OD值為0.30±0.02, 較低氧組降低14% (P＜0.01)。
2.2 VNP對(duì)心成纖維細(xì)胞內(nèi) ~3H-TdR摻入水平的影響
低氧使心成纖維細(xì)胞 ~3H-TdR摻入水平顯著增高, VNP可顯著降低低氧時(shí) ~3H-TdR的摻入水平, 而且有劑量依賴性。對(duì)照組為(100±7)% cpm,低氧時(shí)為(129±14)% cpm, 當(dāng)加入10－８、 10－７ mol/L和10－６ mol/L VNP后, 分別降為(105±8)% cpm、(95±14)% cpm (81±7)% cpm, 較低氧組分別降低18.6%、 26.3%及37.2% (P＜0.05)。當(dāng)加入2.5×10－4 mol/L維拉帕米后, 低氧及常氧組的值均降低, 而且與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.01)。
2.3 VNP對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的影響
低氧使心成纖維細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平顯著升高, VNP可使升高的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平降低. 對(duì)照Ca2+水平為(2.30±0.21)U,低氧時(shí)Ca2+水平為(4.45±0.36)U, 用VNP時(shí)Ca2+水平為(2.96±0.11)U, 顯著小于低氧組(P＜0.05)。
3討論
低氧刺激心成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制還不是很清楚, 但低氧引起肺動(dòng)脈高壓, 其機(jī)械刺激可導(dǎo)致心成纖維細(xì)胞分裂增殖是低氧性心肌肥厚形成的可能機(jī)制之一［2］,低氧還導(dǎo)致交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng), 心肌細(xì)胞及心成纖維細(xì)胞自分泌、 旁分泌增強(qiáng), 多種激素［3～6］促進(jìn)心成纖維細(xì)胞分裂增殖和分泌膠原及其它間質(zhì)成分,后者的作用可能起更重要的作用。這方面的研究正引起學(xué)者的注意和興趣。
booz等報(bào)道, 在乳鼠心成纖維細(xì)胞, AngⅡ刺激的DNA合成至少有一部分是通過(guò)依賴Ca2+通道的［11］。Hou 等報(bào)道, 在人類AngⅡ刺激心成纖維細(xì)胞蛋白合成,是通過(guò)Ca2+敏感依賴PKC酪氨酸激酶途徑的［12］。Angelino C等報(bào)道, l-型Ca2+通道阻斷劑維拉帕米和尼莫地平可抑制去甲腎上腺素(NE)引起的心肌細(xì)胞 ~3H-亮氨酸和心成纖維細(xì)胞 ~3H-TdR摻入, 而且ANP、 S-nitroso-N-acetyl-D、 l-Penicillamine (SNAP)不能增強(qiáng)這種效應(yīng)。在心肌細(xì)胞, Ca2+通道激動(dòng)劑Bay-K8644可增強(qiáng) ~3H-亮氨酸的摻入, 此效應(yīng)可被ANP抑制。說(shuō)明ANP可減弱NE引起的心肌細(xì)胞及心成纖維細(xì)胞增殖作用,這一作用主要是通過(guò)抑制NE刺激的cGMP介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流［13］。
心肌肥厚是細(xì)胞促增殖和抑增殖因素失去平衡的結(jié)果, 以往的研究多集中于促增殖因子如ET-1、 AngⅡ等, 但是從治療的角度看,對(duì)抑增殖因子的研究具有更重要的意義。Cao等［14］報(bào)道, ANP、 NO和cGMP能抑制生長(zhǎng)因子、 AngⅡ和ET-1刺激的心臟成纖維細(xì)胞的DNA 合成。
對(duì)ANP、 CNP、 VNP生理作用的研究最初集中在其利鈉利尿和舒張血管等方面, 近來(lái)研究表明它們還有抑制多種細(xì)胞增殖的作用。如Neuser等［15］的研究表明ANP抑制ET-1刺激血管平滑肌細(xì)胞的增殖作用, galderone等［13］發(fā)現(xiàn)ANP抑制NE刺激心肌細(xì)胞、心成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng), Arjona等［16］發(fā)現(xiàn)CNP抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和肥大,國(guó)內(nèi)吳建明等［17］的研究表明 ANP可以抑制血管平滑肌和心肌細(xì)胞的增殖和c-fos蛋白的表達(dá)。董明清等［18］的研究表明VNP可抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖。于軍等［19］的研究表明VNP可減弱NE對(duì)心肌生長(zhǎng)的刺激作用。
心成纖維細(xì)胞可分泌ET-1, ET-1主要通過(guò)ETA受體介導(dǎo)引起DNA合成增強(qiáng)。AngⅡ刺激ppET-1和c-fos mRNA聯(lián)合表達(dá)可能是通過(guò)激活蛋白激酶C(PKC)介導(dǎo)［4］。最近報(bào)道, 在心成纖維細(xì)胞中ANP、 BNP抑制ET-1、 AngⅡ刺激的DNA和ppET-1 mRNA的表達(dá)［5］。心成纖維細(xì)胞有大量的與鳥苷酸環(huán)化酶結(jié)合的鈉尿肽受體, ANP是通過(guò)三種鈉尿肽受體亞型起作用的［20］, ANP、 BNP升高心成纖維細(xì)胞內(nèi)的cGMP。ANP通過(guò)cGMP直接抑制L型Ca2+通道,使心成纖維細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度降低, 抑制心成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。VNP是人工合成的多肽, 是由ANP羧基末端5個(gè)氨基酸殘基和CNP組合而成, 結(jié)構(gòu)上與ANP、 CNP有很高的同源性,可能具有ANP和VNP的一些功能, 并通過(guò)相同的途徑發(fā)揮生理效應(yīng)。
目前, VNP通過(guò)何種受體發(fā)揮作用尚不清楚。已知ANP、 CNP主要是通過(guò)與膜上鳥苷酸環(huán)化酶(GC)耦聯(lián)受體GC-A、 GC-B結(jié)合激活GC, 升高胞內(nèi)cGMP水平來(lái)發(fā)揮生理作用,亦可與非GC耦聯(lián)的C受體結(jié)合介導(dǎo)自身清除或其它作用。由于VNP系人工設(shè)計(jì)合成, 體內(nèi)因缺乏特異的降解酶, 克服了其它鈉尿肽代謝快、 半衰期短的缺陷。本研究表明, vNP可以抑制低氧刺激的心成纖維細(xì)胞增殖, 并且有劑量依賴性, VNP可以降低低氧引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高,而細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高可以促進(jìn)心成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。說(shuō)明VNP在肺動(dòng)脈高壓、低氧性右心室肥厚、 慢性心力衰竭等疾病的治療中, 可能較ANP、 CNP具有較大的潛在應(yīng)用價(jià)值。
鈉尿肽受體、 第二信使和L型Ca2+通道等是VNP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的幾個(gè)環(huán)節(jié), 在從VNP作用于鈉尿肽受體到心成纖維細(xì)胞的形態(tài)、 功能改變的過(guò)程中,對(duì)Ca2+通道以及PKC下游多級(jí)信號(hào)分子活性的影響, 需要應(yīng)用膜片箝和分子生物學(xué)等技術(shù)進(jìn)一步深入研究。
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received 2000-10-22Accepted 2001-01-13
this work was supported by the National Nature Science Foundation of China(No.39970327)
*Corresponding author. Tel: 029-3374574; Email:mz_zhu@fmmu.edu.cn
本文來(lái)自:大眾醫(yī)藥網(wǎng)
http://www.51qe.cn/pic/30/15/11/23/0454.htm
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