【摘要】 目的 對(duì)進(jìn)行鱟試劑檢測(cè)法實(shí)驗(yàn)，建立參麥注射液細(xì)菌內(nèi)素檢測(cè)法。方法 按2005年版《中國(guó)藥典》所收載的細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)方法，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用不同廠家的鱟試劑對(duì)不同批號(hào)的參麥注射液分別進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，考察確立參麥注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)法。結(jié)果 將參麥注射液稀釋60倍以上可消除干擾作用，檢測(cè)結(jié)果全部為陰性。結(jié)果準(zhǔn)確可靠。結(jié)論 參麥注射液可以用鱟試劑檢查法取代家兔熱源檢查法。
【關(guān)鍵詞】 參麥注射液 細(xì)菌內(nèi)毒素 鱟試劑
1 前言
參麥注射液為一種中藥注射劑，其主要成分為中藥紅參與麥冬的有效成分提取物，具有益氣固脫，養(yǎng)陰生津，生脈之藥理作用，臨床上用于治療氣陰兩虛型之休克，冠心病，病毒性心肌炎，慢性肺心病，粒細(xì)胞減少癥等疾病.本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)驗(yàn)探討以鱟試劑法取代熱原法檢測(cè)參麥注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的可行性。
細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)發(fā)(BET)法是利用鱟試劑來檢測(cè)或量化革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素的一種方法。本方法包括兩種檢查方法，即凝膠法和光度測(cè)定法。本實(shí)驗(yàn)所采用的為凝膠法，是利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反映的機(jī)理，檢測(cè)供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。該方法較熱原檢測(cè)法靈敏，準(zhǔn)確，快速和經(jīng)濟(jì)。美國(guó)藥典(USP)，英國(guó)藥(BP)，歐洲藥典(EP)及日本抗生物質(zhì)基準(zhǔn)均收載了許多品種從熱原檢測(cè)法改為細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)法。[1]縱觀各國(guó)動(dòng)向以BET法取代熱原法是大勢(shì)所趨，同時(shí)也是反映檢驗(yàn)水平提高及標(biāo)準(zhǔn)化的一個(gè)重要標(biāo)志。
2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
2.1材料
2.1.1鱟試劑（廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠，批號(hào)：20070131靈敏度λ=1.0EU/ml；批號(hào)：20080125，靈敏度λ=0.125EU/ml.）鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)20080307 靈敏度λ=0.125EU/ml）。
2.1.2細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)用水（鱟實(shí)驗(yàn)用水）（廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠 批號(hào)20080124；2ml/支）。
2.1.3細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（WSE）（中國(guó)生物制品檢定所，批號(hào)20080321；10EU/支）。
2.1.4參麥注射液（四川川大華西藥業(yè)公司，10ml/支，批號(hào)20080125；批號(hào)20080321）。參麥注射液（河北神威藥業(yè)有限公司，10ml/支，批號(hào)20080521）。
2.1.5等滲氯化鈉注射液（哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)公司，250ml/瓶，批號(hào)20080120）。
2.1.6細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)用具（廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠）均干熱滅菌一小時(shí)以上。
2.2方法
2.2.1鱟試劑的靈敏度的復(fù)核
按《中國(guó)藥典》（2005版）附錄之“細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)法”[2]項(xiàng)下所規(guī)定的“鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)”的內(nèi)容操作。將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上，混勻15min，然后分別稀釋成2.0λ，1.0λ，0.5λ，0.25λ（即1.0EU/ml，0.5EU/ml，0.25EU/ml，0.125EU/ml）四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步，均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30S，每一濃度平行做4支，同時(shí)用鱟實(shí)驗(yàn)用水做2支陰性對(duì)照管。根據(jù)公式λc=1g-1 (Σx/4)分別計(jì)算三個(gè)批號(hào)鱟試劑靈敏度的測(cè)定值(λc)。式中X為待復(fù)核鱟試劑反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值(見表1)。λc均在0.5λ～2.0λ范圍內(nèi)(即0.25≤λ≤1.0)故此鱟試劑可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查并以λ=0.5EU/ml作為三批鱟試劑的靈敏度。
2.2.2干擾預(yù)試驗(yàn)
2.2.3細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)的確定[3]
參麥注射液臨床每次最大用量為40 ml， 加入于250 ml等滲氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液中，在一小時(shí)內(nèi)滴注完畢.根據(jù)2005年版《中國(guó)藥典》規(guī)定的藥品細(xì)菌內(nèi)毒素限值計(jì)算公式，L=K/M得出，M=40/（1*60）=0.67ml/(kg·h)(輸液時(shí)間不足一小時(shí)按一小時(shí)計(jì)算，人均體重按60 kg計(jì)算。靜脈注射計(jì)的致熱閾值K為5EU/（kg·h）。因此細(xì)菌內(nèi)毒素限值L=K/M=5/0.67=0.75 EU/（kg·h）
2.2.4稀釋供試品[4-5]
計(jì)算參麥注射液有效倍數(shù)MVD，按公式：MVD=L/Lλ
當(dāng)Lλ為1.0，0.5，0.25，0.125，0.063EU/ml時(shí)相應(yīng)的MVD(λ=1.0)=7.5，MVD(λ=0.5)=15，MVD(λ=0.25)=30 ，MVD(λ=0.125)=60 ，MVD(λ=0.063)=120，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水把供試品吸釋成以上五個(gè)濃度備用。
2.2.5稀釋內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品
用上述不同濃度樣品系列溶液將內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成2.0EU/ml的濃度備用。
2.2.6加樣及反應(yīng)
進(jìn)行供試品陰性對(duì)照(NPC)和供試品陽(yáng)性對(duì)照(PPC)兩個(gè)系列的反應(yīng)。NPC系列 取上述經(jīng)靈敏度復(fù)核合格的鱟試劑(λ=1.0EU/ml)加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，分別取0.1ml于8支反應(yīng)管中再各加入上述稀釋好的供試品0.1ml，每一供試品濃度，重復(fù)兩反應(yīng)管。PPC系列 取上述鱟試劑（λ=1.0EU/ml）加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，分別取0.1ml于8支反應(yīng)管中，再各加上述稀釋好的2λ的內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品0.1ml，每一供試品濃度重復(fù)兩反應(yīng)管。將兩系列的反應(yīng)管置于（37±1）℃水浴中，保溫(60±2)min，反應(yīng)結(jié)果（見表2）
2.2.7干擾試驗(yàn)
根據(jù)干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)選擇供試品稀釋倍數(shù)為60倍的進(jìn)行干擾試驗(yàn)，即內(nèi)毒素限值為0.125EU/ml。為考察對(duì)于λ=0.125EU/ml的不同廠家鱟試劑，樣品在低于60倍稀釋時(shí)是否也不存在干擾，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將樣品稀釋30 倍及60倍后，分別進(jìn)行干擾試驗(yàn)。干擾試驗(yàn)按《中國(guó)藥典》2005年版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的供試品干擾實(shí)驗(yàn)項(xiàng)進(jìn)行，結(jié)果（見表3）。
藥典規(guī)定當(dāng)Es在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）及Et在0.5Es～到2.0Es（包括0.5Es～2.0Es）時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對(duì)試驗(yàn)沒有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)行不超過MVD的進(jìn)一步稀釋，在重復(fù)干擾試驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于λ=0.125EU/ml的不同廠家鱟試劑，樣品稀釋30倍時(shí)，Es在0.5～2.0λ但Et不在0.5～2.0Es范圍，存在干擾，而樣品稀釋60倍時(shí)Es在0.5～2.0λ且Et在0.5～2.0Es范圍，故認(rèn)為將供試品稀釋60倍以上時(shí)對(duì)不同廠家，生產(chǎn)的鱟試劑不產(chǎn)生干擾。
2.2.8細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法與熱原檢查法對(duì)比試驗(yàn)
2.2.9熱原檢查法
取上述三批參麥注射液按《中國(guó)藥典》2005年版附錄“熱原檢查法”檢查。三批供試品檢查結(jié)果均為陰性。（見表4）
2.2.10細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法
取上述參麥注射液體（每批各取5支）分別用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋60倍，使用靈敏度λ為0.125EU/ml的鱟試劑按《中國(guó)藥典》2005年版附錄之“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法”檢查。結(jié)果全部呈陰性。
3 結(jié)果與討論
3.1上述試驗(yàn)結(jié)果見下列各表：
表1 TAL靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)
TAL 內(nèi)毒素濃度（EU/ml） 陰性對(duì)照 Λc(EU/ml)
1 0.5 0.25 0.125
20080301 ++++ ++++ ---- ---- -- 0.50
20080125 ++++ ++++ +--- ---- -- 0.42
20080307 ++++ ++++ ---- ---- -- 0.50
表2 參麥注射液干擾預(yù)試驗(yàn)
供試品稀釋倍數(shù) 7.5 15 30 60
NPC系列 -- -- -- --
PPC系列 -- -- -- ＋＋
表3 參麥注射液干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果
樣品稀 鱟試劑廠家 樣品批號(hào) 內(nèi)毒素濃度(EU·ml-1) 陰性 結(jié)果
釋倍數(shù) 0.25 0.125 0.06 0.03 對(duì)照
30 廈門鱟試劑試試驗(yàn)廠 檢查用水 ++++ ++++ ---- ---- -- Es=0.125
川大華西藥業(yè) 20080125 ++++ ---- ---- ---- -- Et=0.25
河北神威藥業(yè) 20080321 +++- ---- ---- ---- -- Et=0.297
河北神威藥業(yè) 20080521 ++++ ---- ---- ---- -- Et=0.25
湛江安度斯公司 檢查用水 ++++ ---- ---- ---- -- Es=0.149
川大華西藥業(yè) 20080125 ++++ ---- ---- ---- -- Et=0.297
河北神威藥業(yè) 20080321 ++++ ---- ---- ---- -- Et=0.353
河北神威藥業(yè) 20080521 ++++ ---- ---- ---- -- Et=0.25
60 廈門鱟試劑試驗(yàn)廠 檢查用水 ++++ ++++ ---- ---- -- Es=0.125
川大華西藥業(yè) 20080125 ++++ ++++ ---- ---- -- Et=0.149
河北神威藥業(yè) 20080321 ++++ ++++ -+-- ---- -- Et=0.104
河北神威藥業(yè) 20080521 ++++ ++++ ++-- ---- -- Et=0.089
湛江安度斯生物有限公司 檢查用水 ++++ ++++ ---- ---- -- Es=0.149
川大華西藥業(yè) 20080125 ++++ ++++ -+-- ---- -- Et=0.104
河北神威藥業(yè) 20080321 ++++ ++++ ---- ---- -- Et=0.149
河北神威藥業(yè) 20080521 ++++ ++++ +--- ---- -- Et=0.104
表4 熱源實(shí)驗(yàn)結(jié)果
生產(chǎn)廠家 供試品批號(hào) 檢查結(jié)果
四川川大華西藥業(yè)公司 20080125 （―）
四川川大華西藥業(yè)公司 20080321 （―）
河北神威藥業(yè)公司 20080521 （―）
3.2討論
3.2.1注射劑質(zhì)量控制中，采用家兔法檢驗(yàn)細(xì)菌內(nèi)毒素。由于操作復(fù)雜。影響因素多，而且費(fèi)時(shí)。采用鱟試驗(yàn)法，操作簡(jiǎn)單迅速，且靈敏度高。
3.2.2 BET法檢查細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)機(jī)制如下：內(nèi)毒素在鈣，鎂二價(jià)陽(yáng)離子的參與下，首先激活TAL凝固酶系統(tǒng)的C因子，最后將凝固蛋白原變成凝固蛋白。除與內(nèi)毒素反應(yīng)外，TAL與β—葡聚糖反應(yīng)造成假陽(yáng)性，所以對(duì)一個(gè)新品種進(jìn)行BET法的可行性探討中，最突出的即為干擾實(shí)驗(yàn)，當(dāng)藥品中存在干擾因素時(shí)，均可導(dǎo)致結(jié)果異常，干擾實(shí)驗(yàn)就是確定供試品在什么范圍內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，既可克服干擾因素，又能客觀的反映出供試品所含內(nèi)毒素是否符合規(guī)定限值，為了排除干擾，通常采用稀釋法。如果樣品在高濃度時(shí)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素?zé)o干擾，則在更低濃度時(shí)也不會(huì)產(chǎn)生干擾。
3.2.3初篩試驗(yàn)只是一種預(yù)試驗(yàn)，最終要經(jīng)干擾試驗(yàn)驗(yàn)證，其目的是評(píng)價(jià)樣品濃度對(duì)鱟試劑與內(nèi)毒素凝集反應(yīng)的干擾程度及干擾性質(zhì)，以便初步篩選出對(duì)檢查無干擾的樣品濃度范圍，及相應(yīng)的鱟試劑靈敏度，從而為干擾試驗(yàn)提供必要的參數(shù)，避免鱟試劑的浪費(fèi)。從表3結(jié)果可看出，樣品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾性質(zhì)為抑制作用，樣品對(duì)鱟試劑無干擾的有效稀釋倍數(shù)為60倍。在此有效濃度以下可以選擇靈敏度為0.125EU/ml以上的鱟試劑對(duì)相應(yīng)的樣品稀釋濃度做干擾試驗(yàn)。
由干擾試驗(yàn)結(jié)果可看出，三批樣品分別使用不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑，將樣品稀釋60倍，其Es在0.5λ～2.0λ且Et在0.5Es～2.0Es.按2005年版本《中國(guó)藥典》干擾試驗(yàn)的判斷方法，可以認(rèn)為樣品在該濃度下不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查，因此將樣品稀釋60倍進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查是可行的。
參 考 文 獻(xiàn)
[1] 李勇軍，胡昌勤，金少鴻.四國(guó)藥典抗生素品種細(xì)菌內(nèi)毒素限值的比較.中國(guó)藥事，2000，14（2）：110.
[2] 中國(guó)藥典.2005年版，附錄XI,E,85.
[3] 黃清泉，夏振民.藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì). 藥學(xué)雜志.1997，32（2）：72.
[4] 苑慶華，唐元泰，趙海山等.右旋糖酐20葡萄糖注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè).藥物分析雜志.2001，21（4）：293.
[5] 施震，尹銀嘉，李華.注射用頭孢替唑中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè).中國(guó)藥學(xué)雜志.2003，38（5）：377.
www.chinaqking.com 期刊門戶-中國(guó)期刊網(wǎng) 來源:《中外健康文摘》2009年第16期供稿文/隋秋林 (哈爾濱市第四醫(yī)院 黑龍江哈爾濱 150026）
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