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          生物知識(shí)

          鱟試劑用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)碳酸氫鈉注射液的研究

          作者:admin 來(lái)源:本站 發(fā)布時(shí)間: 2010-09-09 22:49  瀏覽次數(shù):
          購(gòu)買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 m.kjhfd.cn

          摘要 目的:通過(guò)試驗(yàn)以確定碳酸氫鈉注射液可用細(xì)菌內(nèi)毒素代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熱原檢查法。方法:用鱟試劑和家兔做對(duì)照試驗(yàn)確定靈敏度。結(jié)果:用靈敏度為0.125 EU.ml-1的鱟試劑進(jìn)行內(nèi)毒素檢查比家兔靈敏度高12倍。結(jié)論:細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法可以代替熱原檢查法。
          關(guān)鍵詞 碳酸氫鈉注射液;抑制/增強(qiáng)試驗(yàn);細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn);熱原試驗(yàn)

          Study on BET in sodium bicarbonate injection with TAL

          Zhao Xiaomeng(Zhao XM)Yang Jiejiao (Yang JJ), Zhu Yongquan(Zhu YQ)(The Quality-inspection Section of the Pharmaceutical Department in Shenzhen Peoples hospital Shenzhen 518019)

          ABSTRACT OBJECTIVE:To determine whether bacterial endotoxins test(BET) can replace the pyrogen test for the sodium bicarbonate injection.METHODS:The comparative experiment of tachypleus amebocyte lysate(TAL) and rabbits were studied to determine the sensitivity.RESULTS:The sensitivity of TAL test was 0.125 EU.ml1 WORDS , 12 times higher than that of using rabbits.CONCLUSIONS:BET may replace pyrogen test.
          KEYsodium bicarbonate injection, inhibition/strengthen test, bacterial endotoxins test, pyrogen test

            碳酸氫鈉注射液中國(guó)藥典1995年版二部、中國(guó)醫(yī)院制劑規(guī)范第2版均一直沿用家兔法進(jìn)行熱原檢查。針對(duì)醫(yī)院制劑快速檢驗(yàn)的特點(diǎn),開(kāi)展熱原檢查法有一定困難。我們根據(jù)鱟試劑用于藥品中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)具有靈敏、快速、實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),用細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)法對(duì)碳酸氫鈉注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行了檢測(cè),并發(fā)現(xiàn)按細(xì)菌內(nèi)毒素理論限值計(jì)算,此試驗(yàn)濃度進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時(shí)存在假陰性反應(yīng)。針對(duì)這一問(wèn)題我們對(duì)碳酸氫鈉注射液能否用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行了考察,現(xiàn)介紹如下。

          1 實(shí)驗(yàn)材料和用具

            鱟試劑(批號(hào)970702,標(biāo)示靈敏度0.125 EU.ml-1,廈門鱟試劑廠),細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)962,每支為7200 EU,中國(guó)藥品生物制品檢定所),鱟試劑溶解水(BET,批號(hào)970624,每支為2 ml,廈門鱟試劑廠),碳酸氫鈉注射液(批號(hào)970512,970612,970704,深圳市人民醫(yī)院制劑中心),ZH—2旋渦混合器(天津藥典儀器廠),試驗(yàn)用家兔(新西蘭種,廣州試驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)),所用試驗(yàn)用具均經(jīng)除熱原處理。

          2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

          2.1 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素的理論限值計(jì)算

            按中國(guó)藥典1995年版,本品熱原注射劑量M=10 ml.kg-1,靜脈給藥時(shí)臨床無(wú)任何不良反應(yīng),細(xì)菌內(nèi)毒素閾劑量K=5 EU.kg-1,理論限值為L(zhǎng)=K/M=0.5 EU.ml-1。

          2.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核和樣品對(duì)鱟試劑抑制/增強(qiáng)試驗(yàn)

          2.2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核 按中國(guó)藥典1995年版二部方法進(jìn)行。鱟試劑:批號(hào)970702,λb=0.125 EU.ml-1。
          2.2.2 樣品對(duì)鱟試劑抑制/增強(qiáng)試驗(yàn) 取溶解好的細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品,用碳酸氫鈉注射液制成含內(nèi)毒素0.5,0.25,0.125,0.0625 EU
          .ml-1 4個(gè)濃度。每一步均在漩渦混合器上混合30 s,將鱟試劑20管排列成5列,其中4列分別加入供試品陽(yáng)性對(duì)照0.1 ml,另一列為陰性對(duì)照與鱟試劑混合,于37℃水浴中60 min觀察。結(jié)果表明供試品在0.5,0.25,0.125,0.0625,0.03125 EU.ml-1濃度下存在抑制作用,見(jiàn)表1。

          表1 鱟試劑和供試品抑制/干擾試驗(yàn)

          試管號(hào) 內(nèi)毒素濃度/EU.ml-1 反應(yīng)終點(diǎn)濃
          度λc/EU
          .ml-1
          0.5 0.25 0.125 0.0625 0.03125
          鱟敏1 + + + - - 0.125
          試度2 + + + - -
          劑試3 + + + - -
          靈驗(yàn)4 + + + - -
          供擾1 - - - - - 1.0
          試試2 - - - - -
          品驗(yàn)3 - - - - -
          干 4 - - - - -

          2.3 碳酸氫鈉注射液的最高非抑制濃度實(shí)驗(yàn)

            取碳酸氫鈉注射液樣品,稀釋成1∶4,1∶6,1∶8,1∶10,1∶12的濃度,混合均勻取0.1 ml加入到含有0.5,0.25,0.125,0.0625 EU.ml-1細(xì)菌內(nèi)毒素的鱟試劑中,37℃水浴1 h觀察,結(jié)果見(jiàn)表2。經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,碳酸氫鈉注射液濃度在1∶6或以上時(shí),對(duì)鱟試劑有抑制作用;在1∶8以下時(shí),沒(méi)有抑制作用;故碳酸氫鈉注射液最高非抑制濃度為1∶8,試驗(yàn)濃度為1∶10。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

          表2 供試品的最高非抑制濃度試驗(yàn)


          鱟試劑
          樣品
          批號(hào)
          稀釋
          倍數(shù)
          反應(yīng)終點(diǎn)濃
          度λc/EU
          .ml-1
            對(duì)照 溶解水 0.125
            970512 原液 1.0
          0.125   1∶2 1.0
          EU/ml   1∶4 0.297
          批號(hào) 970612 1∶6 0.250
          970704   1∶8 0.125
            970702 1∶10 0.125
              1∶12 0.125

          2.4 碳酸氫鈉注射液試驗(yàn)濃度的干擾試驗(yàn)

            選取3批樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn),用1∶10的供試品將每支為10 EU細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制成
          0.5,0.25,0.125,0.0625 EU
          .ml-1 4個(gè)濃度,測(cè)試1∶10試驗(yàn)濃度下對(duì)鱟試驗(yàn)的干擾情況。其結(jié)果表明,3批碳酸氫鈉注射液樣品對(duì)鱟試驗(yàn)均未出現(xiàn)抑制或增強(qiáng)。

          2.5 家兔法和鱟試驗(yàn)法比較

          2.5.1 用鱟試劑溶解水,將國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品962,每支為7200 EU稀釋成適當(dāng)濃度,加至碳酸氫鈉注射液中,使之制成含內(nèi)毒素1.0,1.2,1.5 EU.ml-1的溶液,分別按熱原檢查法和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法對(duì)各種濃度的內(nèi)毒素溶液進(jìn)行檢查。試驗(yàn)結(jié)果表明,樣品內(nèi)含1.0,1.2 EU.ml-1的內(nèi)毒素均未引起家兔反應(yīng),內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品在劑量為1.5 EU.ml-1時(shí)可致家兔明顯發(fā)熱反應(yīng),而這3種濃度下的鱟試驗(yàn)法均為陽(yáng)性反應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)試驗(yàn)表明,細(xì)菌內(nèi)毒素法在內(nèi)毒素濃度為0.125 EU*ml-1時(shí)鱟試劑已凝集,按兩種方法產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)內(nèi)毒素濃度之比1.5/0.125=12,即確定內(nèi)毒素法靈敏度是熱原法的12倍。

          表3 熱原法和細(xì)菌內(nèi)毒素法的比較

          內(nèi)毒素濃
          度/EU*ml-1
          體重
          /kg
          第一次測(cè)
          溫/℃
          第二次測(cè)
          溫/℃
          平均體溫
          /℃
          注射后第一
          次測(cè)溫/℃
          注射后第二
          次測(cè)溫/℃
          注射后第三
          次測(cè)溫/℃
          最高溫度
          /℃
          溫差
          /℃
          1.0 2.80 38.95 38.95 38.95 39.25 39.45 39.25 39.70 0.55
          2.85 39.45 39.35 39.40 39.85 39.45 39.35 39.85 0.45
          2.90 38.90 38.85 38.875 39.25 39.30 39.00 39.30 0.425
          1.2 2.70 38.70 38.90 39.00 39.20 39.15 38.90 39.20 0.20
          2.80 38.70 38.60 38.65 39.05 39.05 39.05 39.05 0.40
          2.85 38.65 38.55 38.60 39.05 38.95 39.15 39.15 0.55
          1.5 2.75 38.75 38.65 38.70 39.45 39.35 38.90 39.45 0.75
          2.65 38.55 38.45 38.50 41.50 39.65 39.30 41.50 3.00
          2.80 38.60 38.40 38.50 38.85 39.25 39.65 39.65 1.15
          加入內(nèi)毒素濃度(EU.ml-1) 1.5 1.2 1.0 0.5 0.25 0.125 0.0625 0.03125
          樣品濃度(1∶10) s-118.GIF (881 bytes) s-118.GIF (881 bytes) s-118.GIF (881 bytes) s-118.GIF (881 bytes) s-118.GIF (881 bytes) s-118.GIF (881 bytes)

          注:①按家兔10 ml/kg劑量注射。②實(shí)驗(yàn)時(shí)室溫為26℃,室內(nèi)無(wú)任何干擾

          3 討 論

          3.1 碳酸氫鈉注射液的PH為7.5~8.5左右。將原液或1∶2溶液加入鱟試劑中后,出現(xiàn)白色混濁。通過(guò)抑制試驗(yàn)表明,對(duì)鱟試劑的凝集反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)烈干擾,出現(xiàn)假陰性;在濃度1∶8時(shí),則無(wú)干擾。

          3.2 碳酸氫鈉注射液按最大有效稀釋倍數(shù)D=L/λ計(jì)算應(yīng)稀釋4倍,但經(jīng)最高非抑制濃度試驗(yàn)表明,在此濃度下仍有干擾,故加大稀釋倍數(shù)。通過(guò)抑制/增強(qiáng)試驗(yàn)表明,將碳酸氫鈉注射液樣品1∶10稀釋后,用標(biāo)示靈敏度0.125 EU*ml-1的鱟試劑檢測(cè)樣品細(xì)菌內(nèi)毒素時(shí),無(wú)抑制/增強(qiáng)作用。

          3.3 經(jīng)試驗(yàn)表明,細(xì)菌內(nèi)毒素法比家兔法靈敏度高12倍,即碳酸氫鈉注射液用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法可以代替熱原檢查法。

          作者單位:趙曉萌 楊戒驕 朱永泉 (深圳518019深圳市人民醫(yī)院藥學(xué)部質(zhì)檢室)

          (收稿:1998-04-06)

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