lonza 無血清 培養(yǎng)基
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牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)在分類學上屬黃病毒科(Flaviviridae)，瘟病毒屬(Pestivirus)成員，與屬內的豬瘟病毒(classi—calswinefever virus，CSFV)及羊邊界病毒(borderdiseasevirus，BDV)在血清學上有交叉反應。BVDV感染的牛能引起多種臨床癥狀，如高熱、腹瀉、流涎、停食、白細胞減少、免疫抑制、黏膜充血等，還能引起奶牛產奶量下降，孕牛流產、產死胎及牛的持續(xù)性感染。野生反芻動物對BVDV非常敏感，尤其是鹿科動物更易感，在南達科他東南部的兩頭白尾鹿體內檢測到了BVDV，并且在幼鹿中可持續(xù)感染。E2囊膜糖蛋白是BVDV抗原性的主要決定部分，同時又是變異率較高的一種結構蛋白，其變異可引起B(yǎng)VDV中和逃逸，導致動物持續(xù)感染。BVDV的檢測方法也很多，Semrau等用熒光定量PCR對大量的樣品進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)從血清樣品中檢測到BVDV呈陽性的樣品數(shù)量比口、鼻分泌物樣品多。酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)具有敏感、準確、快速、簡單等優(yōu)點，結合單抗應用具有很大的優(yōu)勢，抗BVDV單克隆抗體在牛病毒性腹瀉病臨床診斷，特別在研究BVDV抗原基因變異方面起著重要作用。我們在研究中用BVDVE2表達蛋白免疫Balb／c小鼠，研制出5株單抗，并在此基礎上開展了抗原捕獲ELISA(AC-ELISA)的研究工作。
1 材料與方法
1．1 病毒、單抗和陰性腹水
sf9昆蟲細胞表達的BVDVE2蛋白來自軍事獸醫(yī)研究所病毒室，抗BVDV E2蛋白單克隆抗體4G3(ELISA效價1．8X10 5)自制。陰性腹水自制。
1．2 試驗動物
1．5—2．0 kg的健康雌性家兔購自衛(wèi)生部長春生物制品所，用于制備多抗。新生小牛購自長春市郊奶牛場，試驗前檢測BVDV為陰性，用于制備陰性小牛血清。
1．3 主要試劑
蛋白A凝膠(ProteinA Sepharose)及抗體純化層析柱購自BIOTECH公司，HRP標記的羊抗兔IgG、鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)等均購自SIGMA公司。細胞培養(yǎng)基Grace為GIBCOBRL公司的產品；PAGE低分子量蛋白Marker購自TAKARA公司；PEG600購自上海生物工程有限公司；BCA試劑盒購自Pierce公司。
1．4 單抗純化鑒定
將IgM亞型的單抗4G3采用PEG6000純化，純化后的單抗用SDS-PAGE鑒定純度和BCA試劑盒測定濃度后低溫保存?zhèn)溆谩?
1．5 多抗的制備、純化和濃度測定
以弗氏完全佐劑(FCA)乳化桿狀病毒表達并純化的BVDVE2蛋白免疫家兔，分點皮下注射1 000μg／只，共免疫3只。2周后以弗氏不完全佐劑(FIA)乳化蛋白分點皮下注射相同劑量，最后一次免疫，直接用生理鹽水稀釋蛋白皮下注射1 000μg的重組E2蛋白抗原。2周后采血測抗體效價。待抗體達到要求后殺兔采血，分離血清。將兔血清采用蛋白A(Protein A Sepharose)柱層析法純化，純化后的IgG用SDS-PAGE鑒定純度和BCA試劑盒測定濃度后低溫保存?zhèn)溆谩?
1．6 NP-40處理制備BVDV抗原
將桿狀病毒表達BVDV E2蛋白的sf9細胞接種至細胞培養(yǎng)瓶，待鋪滿整個瓶底時將細胞培養(yǎng)物反復凍融3次，1 503 g／min離心，收集細胞上清原液，加人1％細胞原液量含1％NP-40的PBS緩沖液，室溫旋渦震蕩1．5-2 h，然后601 g／min 4℃離心10min，上清作為被檢陽性抗原，用同樣方法處理的sf9細胞上清作為陰性對照。
1．7 單抗和多抗最佳使用濃度的篩選
采用方陣滴定法，將純化后的單抗和多抗分別稀釋至20 μg／mL、10μg／mL、5μg／mL、2 μg／mL、1 μg／mL、0．5μg／mL 6個不同濃度，包被酶標板，4℃過夜后，以1％BSA的PBS溶液37℃封閉1 h，用0．15％吐溫-20的PBS洗3次后加入NP-40處理的BVDV細胞培養(yǎng)抗原，同時加入同種方法處理的正常細胞培養(yǎng)物做陰性對照，37 ℃作用1 h；用含1％明膠的PBS溶液37 ℃封閉1h；加入不同濃度的兔抗BVDVIgG(20、10、5和2μg／mL)，37 ℃作用1 h；洗滌后加入羊抗兔酶標抗體(Sigma)，37 ℃作用1 h；再次洗滌后加入新配的底物溶液TMB+H2O2，37 ℃作用15 min；用2mol／LH2SO4溶液終止后檢測OD450值，確定抗體的最佳工作濃度。
1．8 單抗包被條件和多抗作用條件的確定
采用方陣滴定法，將篩選的單抗和多抗分別按最佳使用濃度稀釋，單抗采用37℃2 h、4℃12 h、4℃24h和37℃1 h后4℃ 12h4種包被條件，多抗則采用37 ℃分別作用2h、1 h和30min的工作條件，按1．7步驟進行ELISA，分別檢測NP-40處理的陰、陽性抗原，根據(jù)結果選擇單抗的最佳包被條件和多抗的最適作用條件。
1．9 封閉劑的應用選擇
用單抗包被酶標板，分別用1％BSA、1％明膠、1％BSA+1％明膠、1％BSA+1％明膠應用2次(單抗包被后和待檢抗原作用后)4種方式封閉，然后按1．7步驟進行ELISA，分別檢測NP-40處理的陰、陽性抗原，根據(jù)結果選擇封閉劑的最佳應用方法。
1．10 酶標抗體工作條件的選擇
酶標抗體分別按1：100、1：1 000、1：10 000、1：100 000倍稀釋，反應條件為37℃分別作用2h、1 h和30min，按1．7步驟進行ELISA，分別檢測NP-40處理的陰、陽性抗原，根據(jù)結果選擇酶標抗體的最佳工作濃度和作用時間。
1．11 AC-ELISA方法陰性樣品臨界值的確定
以24份來自健康牛的脾臟組織懸液為待檢測樣品，進行上述AC—ELISA。每份樣品重復2孔，在樣品OD450值符合正態(tài)分布的條件下計算樣品平均OD450值(x)和標準差(s)，按文獻計算陰性樣品的臨界值。
1．12 AC-ELISA重復性試驗
用單抗包被4塊酶標板，在每一塊板內分別檢測1份BVDV細胞培養(yǎng)抗原和4份牛病毒性腹瀉病組織病料，同時用1份正常細胞培養(yǎng)物做陰性對照，每份樣品在每塊板中重復4孔，AC-ELISA方法進行檢測。結果用SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析，計算樣品OD450值在不同板間和板內不同孔間的變異系數(shù)，檢驗板內和板間檢測樣品的重復性。
1．13 AC-ELISA在臨床牛病毒性腹瀉病樣品檢測中的應用
11份臨床牛病毒性腹瀉病疑似病例脾臟組織和12份健康牛脾臟組織，分別研磨勻漿后用1％NP-40處理，用AC-ELISA方法檢測BVDV抗原，同時用正常細胞培養(yǎng)物做陰性對照。上述樣品分別用病毒分離和RT-PCR方法平行檢測做對比。
2 結果
2．1 單抗純化鑒定和濃度測定
純化前后的單抗SDS-PAGE如圖1，由圖可見純化后的單抗在68 ku和25 ku附近有兩條明顯的條帶(分別是IgM的重鏈和輕鏈)，與預期的大小條帶相符。而未純化的泳道上出現(xiàn)多條雜帶。表明單抗純化結果較理想。
2．2 多抗效價測定、純化和濃度測定
采用倍比稀釋法測得純化后的多抗效價為1．2X10 4。純化前后的多抗SDS-PAGE如圖2，圖中顯示IgG在50ku和25 ku附近出現(xiàn)了明顯的條帶，代表IgG的重鏈和輕鏈，與預計大小相符，未純化多抗則有很多雜帶。表明上述純化結果很理想。經BCA試劑盒方法測定多抗的濃度為9．08 mg／mL。
2．3 單抗和多抗最佳使用濃度的篩選
方陣滴定法篩選單抗和多抗最適工作濃度，結果見表1。單抗4G3和兔抗BVDVIgG濃度分別為5和10μg／mL時，檢測BVDV細胞培養(yǎng)抗原的OD450值為1．023，接近于1．0，且正常細胞培養(yǎng)物的OD450值為0．312，P／N值(3．278)最大，確定AC—ELISA試驗中單抗和多抗的最適工作濃度分別為5和10μg／mL。
2．4 單抗包被條件和多抗作用條件的確定
以最適單抗?jié)舛炔捎?7 ℃ 2h、4 ℃ 12h、4 ℃24h和37℃1 h后4℃12h4種包被條件，多抗則采用37℃分別作用2h、1 h和30 min 3種不同的工作條件，組成方陣進行AC-ELISA，分別檢測NP-40處理的陰、陽性抗原，結果見表2。
單抗在4℃包被12 h，多抗在37 ℃作用1 h，BVDV陽性抗原OD450值1．032，陰性OD450值0．320，P／N值為3．225；單抗在4℃包被24 h，多抗在37℃作用1 h，BVDV陽性抗原OD450值1．066，陰性OD450值0．315，P／N值為3．384。此兩種條件下的陽性抗原OD450值均接近1．0，P／N值均較大，單抗在4℃包被12—24h，多抗在37℃作用1 h可作為雙抗體的最佳反應條件。
2．5 封閉劑的應用選擇
分別用1％BSA、1％明膠、1％BSA+1％明膠、1％BSA+1％明膠應用2次(單抗包被后和待檢抗原作用后)4種方式封閉后進行AC-ELISA，分別檢測NP-40處理的OD450值BVDV陰、陽性抗原，結果見圖3，用1％BSA+1％明膠封閉2次，陽性抗原OD450值最高，陰性抗原OD450值最低，P／N值最大，為最佳封閉條件。
2．6 酶標抗體的工作濃度和工作時間的選擇
羊抗兔IgG分別做1：100、1：1 000、1：10 000、1：100 000倍稀釋，在37℃分別作用2h、1 h和30 min，進行AC-ELISA，檢測NP-40處理的BVDV陰、陽性抗原，結果見表3，酶標抗體按1：10000稀釋后37 ℃作用1 h，測得BVDV陽性抗原OD450值最高，陰性抗原的OD450值較低，P／N值較大，為最佳反應條件。
2．7 AC-ELISA方法陰性樣品臨界值的確定
用AC—ELISA方法檢測24份BVDV陰性的牛組織樣品，其OD450值介于0．242和0．346之間(圖4)。用SPSS 8．0軟件進行統(tǒng)計學分析，24份樣品的OD45。值符合正態(tài)分布，OD450值的平均數(shù)(x)和標準差(s)分別為0．301和0．031，根據(jù)文獻計算陰性樣品的臨界值為x+3xs=0．393。根據(jù)統(tǒng)計學原則，OD450值>0．393時，可以在99．9％的可信度上判定為陽性，能夠作為檢測結果的判斷標準。為了減少假陽性或假陰性結果，將臨界值加上和減去1個標準差的范圍作為一個可疑區(qū)間(即OD450值0．362—0．424)，介于可疑區(qū)間內的結果需要重檢。
2．8 AC-ELISA方法的重復性試驗
用已建立的AC—ELISA方法對1份陽性抗原(BVDV細胞培養(yǎng)物)、1份陰性抗原(陰性細胞培養(yǎng)物)和4份疑似BVDV感染牛的脾臟組織分別在不同板間及板內不同孔間進行重復檢測，結果見表4。根據(jù)SSPS 8．0統(tǒng)計軟件中的隨機單位組設計資料的S-N-K方差分析方法進行分析。不同板間比較，F(xiàn)=0．833，P=0．479>0．05；板內不同孔間比較，F(xiàn)=0．103，P=0．958>0．05。二者差異均無顯著意義，說明AC-ELISA方法在不同板間和板內不同孔間檢測同一樣品差異不顯著。根據(jù)公式CV=S／Xx100％計算，6個樣品在板內和板間的總變異系數(shù)均小于10％，可見該方法無論對陰、陽性細胞培養(yǎng)抗原還是臨床組織樣品進行檢測均具有較好的重復性。
2．9 AC-ELISA在臨床牛病毒性腹瀉病樣品檢測中的應用
用AC—ELISA方法檢測臨床采集的牛病毒性腹瀉病料，同時以病毒分離和RT-PCR方法檢測做對比。用AC-ELISA、病毒分離和RT-PCR方法對11份臨床牛病毒性腹瀉病料的檢測結果分別見表5，3種方法對12份健康牛組織樣品的檢測結果均為陰性。
3 討論
牛病毒性腹瀉至今仍是世界范圍內嚴重威脅養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的傳染病，各國對該病都十分重視，投入很大的人力和物力進行研究。就目前BVDV的診斷技術研究水平來看，遠遠滯后于BVDV其他方面的研究進展，如何建立快速、準確的BVDV檢測方法是當前BVDV防制工作的迫切要求。多年來，國內外先后建立了病毒分離、免疫熒光試驗、單層免疫酶、酶聯(lián)免疫酶和RT-PCR檢測方法。ELISA方法以其快速、靈敏、簡單并便于同時檢測大量樣品而受到人們的重視。目前國內BVDV檢測方法還是以初步純化的BVDV細胞培養(yǎng)物作為抗原檢測BVDV抗體為主，缺乏理想的BVDV抗原檢測方法。由于國外抗原檢測試劑盒價格過于昂貴，在國內難以推廣，建立一種敏感、快速、易操作的直接檢測牛病毒性腹瀉病抗原的試驗方法已成為BVDV診斷工作的迫切要求。本試驗用自行研制的BVDV單抗與兔抗BVDVIgG聯(lián)合應用，建立了雙抗體夾心間接ELISA方法用于捕捉BVDV抗原，將單抗的高度特異性和ELISA方法的高度敏感性有機地結合起來，達到了BVDV早期診斷和快速檢測的目的。AC-ELISA方法具有快速、經濟和敏感等優(yōu)點，明顯優(yōu)于病毒分離、IPMA和IFA等，而且具有半自動化的特點，能自動顯示結果，因此更適宜于短時間內檢測大批量樣品，適合于各級獸醫(yī)研究機構和生產單位應用。
在AC-ELISA方法的建立中抗體的親合力是試驗成功的關鍵，只有制備出高效價、高親合力的特異性抗體才有可能取得成功。我們研制的單抗效價高，親合力強，為方法的建立打下了良好的基礎。同時制備了兔抗BVDV高免血清并純化了IgG，取得了較好效果。
非特異性反應是影響ELISA結果最重要的因素，特別是在雙抗體夾心ELISA中，參與反應的成分多，需要多重抗原抗體反應步驟，因此降低非特異性反應尤其重要。在消除非特異性反應過程中，封閉劑的選擇和合理應用非常關鍵。由于擔心動物血清中未知雜蛋白含量過多，有可能對試驗結果造成影響，本試驗中采用BSA和明膠作為封閉劑，并進行了封閉方式篩選試驗，確定了將1％BSA和1％明膠分別在抗體包被后和加入待檢抗原反應后進行兩次封閉，取得滿意效果。
ELISA方法中結果的判定與特異性和敏感性密切相關，目前還沒有統(tǒng)一的判定標準，一般公認的判定方法是通過檢測大量已知的陰性樣品，用統(tǒng)計學方法計算結果的平均數(shù)、平均數(shù)的99％可信區(qū)間和標準差，確定一個在99％的可信度上區(qū)分陰、陽性結果的臨界值。張札壁報道對10份以上已知陰性樣品分別檢測，取OD值平均值加上3倍標準差的和可作為臨界值，當被檢樣品的OD值高于此值時，可判定為陽性。本試驗中應用24份經病毒分離和RT-PCR方法鑒定為BVDV陰性的牛脾臟組織分別用AC—ELISA方法進行檢測，采用平均數(shù)加3倍標準差的方法確定樣品陰性臨界值為0．393，根據(jù)統(tǒng)計學原則，凡未知樣品的OD值高于此值時，可以在99．9％的可信度上判定為陽性，能夠作為檢測結果的判斷標準。此外，本試驗還設定了一個可疑值范圍，對介于可疑區(qū)內的樣品進行重檢，減少了假陽性或假陰性結果機率。
總之，本試驗建立的BVDVAC-ELISA方法將單抗的特異性和ELISA方法的敏感性有機地結合起來，能夠短時間內準確、快速地直接檢測大批量樣品中的BVDV抗原，明顯優(yōu)于病毒分離和免疫熒光等方法，而且具有半自動化的特點，能自動顯示結果，更適合于各級獸醫(yī)研究機構和生產單位應用。
lonza 無血清 培養(yǎng)基
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