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【摘 要】 采用廣州甘蔗糖業(yè)研究所和廈門大學(xué)共同研制的抗葡聚糖多克隆抗體和DEX-OVA交聯(lián)的免疫原，確定了最佳的抗原包被濃度為5ug/ml，最佳的多抗工作濃度為1：8000。建立了競爭抑制ELISA定量檢測葡聚糖的方法；并嘗試了對原糖樣本的檢測。
【關(guān)鍵詞】 葡聚糖；多克隆抗體；競爭抑制ELISA；定量檢測；原糖
前言
從原理上說，葡聚糖的檢測方法大體上可分為兩大類：一類是基于葡聚糖發(fā)生化學(xué)變化的原理，即通過化學(xué)反應(yīng)使葡聚糖變成可直接檢測的其它物質(zhì)進行測定，如Robert銅法是葡聚糖用硫酸水解后變成葡萄糖，再用酚顯色，通過測定葡萄糖的量來推算葡聚糖的含量[1]；另一類是基于葡聚糖物理性質(zhì)的原理，如Haze法、SPRI法，是利用葡聚糖會在酒精中沉淀，產(chǎn)生濁度，通過比較濁度的大小而判定葡聚糖的含量。但目前常用的葡聚糖定量檢測方法都存在預(yù)處理困難、操作復(fù)雜、雜質(zhì)干擾嚴重影響結(jié)果等缺陷[2]，免疫學(xué)檢測法是一個很有希望的方向，具有快速、準確、樣本預(yù)處理簡單等優(yōu)點，適合于制糖工藝任一工序中葡聚糖含量的測定。
本文采用廣州甘蔗糖業(yè)研究所和廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院共同研制的葡聚糖多克隆抗體[3]，初步建立了葡聚糖的競爭抑制ELISA檢測方法。
1 材料與方法
1.1 主要儀器及試驗材料
BIO-RAD 680酶標儀；Dextran 40、2000為Pharmacia公司產(chǎn)品；抗葡聚糖陽性抗體為StemCell產(chǎn)品，其它試劑為國產(chǎn)試劑；葡聚糖多克隆抗體為廣州甘蔗糖業(yè)研究所和廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院共同研制。
1.2 葡聚糖競爭抑制ELISA方法的建立
1.2.1 方陣法確定抗原包被濃度和抗體的工作濃度[4]
將Dextran T40-OVA交聯(lián)物按2.5、5、10、20μg/mL橫向包被酶標板，每孔100μL（純化的抗體經(jīng)適當稀釋后與梯度稀釋的標準葡聚糖溶液各50μL），37℃，過夜。用封閉液（10%正常人血清）封閉2h；每孔加入不同稀釋度的多抗100ul（1：1000……1：128000），同時設(shè)立陽性、陰性對照，37℃放置1h；用PBST洗滌液洗3次后,加羊抗兔酶標二抗，37℃放置1h；再用PBST洗3次，加入OPD底物溶液，37℃避光放置15min；加終止液（2M H2SO4溶液）終止反應(yīng)。酶標儀讀取OD490結(jié)果，根據(jù)OD490值及具體情況確定包被濃度和抗體的工作濃度。
1.2.2 葡聚糖競爭抑制ELISA方法的建立[5]
應(yīng)用葡聚糖多克隆抗體，建立葡聚糖抑制競爭ELISA法。以Dextran 40-OVA交聯(lián)物最佳包被濃度5ug/ml包被96孔板，設(shè)陽性、陰性對照?？贵w為確立的最佳稀釋度（1：8000），標準競爭抑制物為梯度稀釋的葡聚糖，進行板內(nèi)競爭反應(yīng)1h，其他步驟同上述間接ELISA方法[3]。根據(jù)酶標儀讀取OD490的數(shù)值，計算抑制率，以抑制率（A標/A0×%）為縱坐標，以抑制濃度為橫坐標，繪制葡聚糖標準曲線。
1.2.3 葡聚糖競爭抑制ELISA方法[6]檢測原糖樣本
以Dextran 40-OVA交聯(lián)物最佳包被濃度5ug/ml包被96孔板，設(shè)陽性、陰性對照。抗體為確立的最佳稀釋度（1：8000），為消除蔗糖在過程中的影響，用與原糖濃度相同的蔗糖溶液和梯度稀釋的葡聚糖混合液作為標準競爭抑制物，進行板內(nèi)競爭反應(yīng)1h，其他步驟同上述間接ELISA方法。根據(jù)酶標儀讀取OD490的數(shù)值，計算抑制率，作出標準曲線。
同時以Dextran 40-OVA交聯(lián)物最佳包被濃度5ug/ml包被96孔板，設(shè)陽性、陰性對照?？贵w為確立的最佳稀釋度（1：8000），用原糖樣本作為競爭抑制物，進行板內(nèi)競爭反應(yīng)1h，其他步驟同上述間接ELISA方法。根據(jù)酶標儀讀取OD490的數(shù)值，計算抑制率，和標準曲線中的抑制率比較，可得到原糖中葡聚糖的含量值。
2 結(jié)果與分析
2.1 最佳包被濃度與抗體稀釋度的確立
ELISA實驗結(jié)果見表1。根據(jù)表中的試驗數(shù)據(jù)，在其它因素相同的情況下，在包被濃度5ug/ml，稀釋度為1：8000時，OD490值為1.365。
表1 Dextran 40-OVA包被濃度與抗體稀釋度的篩選
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Dextran 40-OVA (ug/ml)
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多抗稀釋度
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1/1000
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1/2000
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1/4000
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1/8000
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1/16000
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1/32000
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1/64000
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1/128000
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2.5
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1.329
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0.935
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0.441
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0.204
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0.145
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0.082
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0.062
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0.038
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5
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2.922
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2.53
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2.019
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1.365
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0.908
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0.617
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0.368
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0.195
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10
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1.74
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1.506
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0.651
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0.26
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0.16
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0.098
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0.071
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0.047
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20
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1.767
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1.274
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0.563
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0.223
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0.105
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0.08
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0.053
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0.019
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0
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0.007
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0.005
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0.005
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0.006
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0.007
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0.007
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0.006
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0.006
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根據(jù)OD值應(yīng)在1.0～1.5之間，且包被抗原及單抗用量少的原則，我們選擇包被濃度為5ug/ml，抗體的稀釋度為1：8000。
2.2 葡聚糖競爭ELISA標準曲線的建立
標準葡聚糖抑制濃度按1024ug/ml倍比稀釋，用已經(jīng)建立的ELISA方法做間接競爭抑制ELISA檢測，實驗結(jié)果表明，當葡聚糖濃度大于512ug/ml時，反應(yīng)完全被抑制；當葡聚糖濃度小于0.06ug/ml時，反應(yīng)幾乎不被抑制。
以葡聚糖標準品濃度為橫坐標，以抑制率（A標/A0×100）為縱坐標繪制標準曲線，取線性關(guān)系良好的范圍作曲線，見圖1。數(shù)據(jù)用EXCEL分析，曲線擬合方程為y=-5.9409x+94.618，相關(guān)系數(shù)R2=0.9951。
圖1 ELISA標準曲線
2.3 原糖樣本中葡聚糖含量的檢測
2.3.1 檢測原糖標準曲線
為消除蔗糖對測定結(jié)果的影響，標準競爭抑制物為蔗糖和葡聚糖混合液，其中蔗糖濃度為100mg/mL保持不變，葡聚糖標準品濃度1mg/mL起倍比稀釋，結(jié)果見圖2。
圖2 檢測原糖標準曲線
2.3.2 原糖樣本檢測
原糖樣本濃度為100mg/mL，抑制率為26.29%，從圖中可知此時葡聚糖濃度約為40。即原糖中葡聚糖含量為400×10-6。
3 討論
本研究采用廣州甘蔗糖業(yè)研究所和廈門大學(xué)共同研制的抗葡聚糖多克隆抗體和DEX-OVA交聯(lián)的免疫原，確定了最佳的抗原包被濃度為5ug/ml，最佳的多抗工作濃度為1：8000。
以純化的抗葡聚糖多克隆抗體為檢測抗體，建立了競爭抑制ELISA定量檢測葡聚糖的方法；從試驗結(jié)果說明此方法葡聚糖的檢出限為0.06×10-6至512×10-6。
該抗葡聚糖多克隆抗體具有特異性強，效價高的特點，建立的競爭抑制ELISA定量檢測葡聚糖的方法具有簡便、靈敏、準確等優(yōu)點。
嘗試了對原糖樣本的實際檢測，該原糖樣本用《原糖》國標的酒精沉淀法測定，結(jié)果葡聚糖含量為483×10-6。由于酒精沉淀法測定的是總多糖的量，結(jié)果可能偏高，免疫法測定的結(jié)果比國標法測定結(jié)果稍低，是可以接受的。
參考文獻
[1]陳其斌,周重吉.甘蔗制糖手冊（第十二版）[M].華南理工大學(xué)出版社,1993.
[2]Christine F. Brown，Peter A.Inkerman. Specific Method for Quantitative Measurement of the Total Dextran Content of Raw Sugar,J.Agric.Food Chem.1992,40,227-233.
[3]曾練強,王生育,李雨虹等.葡聚糖多克隆抗體制備與純化[M].廣西輕工業(yè),2009,(11）:4-5.
[4]JEROEN DOUWES, GERT DOEKES,ROY MONTIJN，et al. Measurement of b(133)-Glucans in Occupational and Home Environments with an Inhibition Enzyme Immunoassay，APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,Sept.1996,p.3176–3182.
[5]聞平,郭月芳.(1，3)一D一葡聚糖ELISA檢測方法建立及初步臨床應(yīng)用[M].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2003,l8(5):1-2.
[6]陳蘭明,陳永董.黃曲霉毒素B1直接競爭抑制ELISA快速篩選法的建立[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1998.21(4):62-65.
[作者簡介]曾練強，男，高級工程師，從事化學(xué)、微生物學(xué)等方面的研究工作。
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