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購買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 m.kjhfd.cn |
【摘要】 目的:應(yīng)用動態(tài)濁度法定量檢測痰熱清注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素。方法:采用中國藥典2005年版附錄細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測法。結(jié)果: 將痰熱清注射液進(jìn)行1∶80稀釋,可排除干擾,回收率在50%~200%,無干擾作用。結(jié)論:應(yīng)用動態(tài)濁度法測定痰熱清注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素是可行的。 【關(guān)鍵詞】 動態(tài)濁度法;痰熱清注射液;細(xì)菌內(nèi)毒素;干擾實驗 痰熱清注射液是由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花和連翹制成的中藥復(fù)方注射劑,臨床上用于風(fēng)溫肺熱病屬痰熱阻肺證。本品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]中規(guī)定其致熱物質(zhì)檢查為熱原檢查法,該法操作復(fù)雜、時間長、費用高。本文通過動態(tài)濁度法定量檢測痰熱清注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量,建立痰熱清注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素定量分析的方法。 1 材料與儀器 動態(tài)濁度鱟試劑(批號:0411260,0409228,1.25 mL/支,湛江安度斯生物有限公司);細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(批號:200610,160 Eu/支,中國藥品生物制品檢定所);痰熱清注射液(批號:050915、050926、051026、051125,10 mL/支,新誼醫(yī)藥集團(tuán)·上海凱寶藥業(yè)有限公司);BET32B型細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀(天津大學(xué)無線電廠);ZH2型漩渦混合器(天津藥典儀器廠)。 2 方法與結(jié)果 2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定[2] 人體每小時可以接受的最大內(nèi)毒素劑量為[5.0 EU/(kg·h) × 60 kg]=300 EU/h(人均體重按60 kg計算);按痰熱清注射液使用說明書,20 mL/次,加入5%葡萄糖注射液500 mL,控制滴數(shù)在60滴/min內(nèi)(按每1 mL為20滴計算),另葡萄糖注射液的內(nèi)毒素限量為0.5 EU/mL;故痰熱清注射液允許帶入的內(nèi)毒素最大限量為[300×(500+20)×20/(60×60)-500×0.5]÷20=30.8 EU/mL。本試驗采用30.8 EU/mL作為細(xì)菌內(nèi)毒素限值。 2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及可靠性[3] 用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行溶解稀釋,使其最終內(nèi)毒素濃度分別為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312 Eu/mL稀釋系列。各取0.2 mL分別加到預(yù)先加有0.1 mL動態(tài)濁度鱟試劑反應(yīng)管內(nèi),混合均勻。立即插入BET32B型細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀進(jìn)行自動檢測,其中每一濃度做3支平行管,并同時做2支陰性對照管(NC)。結(jié)果見表1。表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(略) 結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線為lgT=2.81660.3533lgC,r=0.9928,|r|>0.980,標(biāo)準(zhǔn)曲線最低內(nèi)毒素濃度點λ1=0.0312 Eu/mL,陰性對照的反應(yīng)時間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時間,標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。 2.3 干擾實驗 2.3.1 供試品最大稀釋倍數(shù)計算[3] 按公式MVD=L·C/λ,L為痰熱清注射液細(xì)菌內(nèi)毒素限值,C為100%,λ為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低內(nèi)毒素濃度0.0312 Eu/mL,得最大稀釋倍數(shù)(MVD)為987倍。 2.3.2 供試品溶液配制及預(yù)干擾實驗[4] 將痰熱清注射液(批號:050915)用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水依次稀釋為1∶20、1∶40、1∶80、1∶160等比系列稀釋液,作為供試品空白管(Ct),記為A液。同時另分別取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為2 λm (λm為中點濃度0.125 Eu/mL)和供試品各等比系列的2倍濃度稀釋液,在稀釋用試管中等量混合,得到在此稀釋倍數(shù)下含λm內(nèi)毒素的供試品溶液,作為供試品陽性管(Cs),記為B液。分別取上述溶液各0.2 mL加入預(yù)先加有0.1 mL動態(tài)濁度法鱟試劑反應(yīng)管內(nèi),混合均勻。立即插入BET32B型細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀進(jìn)行自動檢測,其中每一濃度做2支平行管,并同時做2支陰性對照管(NC)。計算回收率,回收率(%)=(Cs-Ct)/λm×100%,結(jié)果見表2。表2 預(yù)干擾實驗結(jié)果(略) 結(jié)果可見,陰性對照內(nèi)毒素小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低內(nèi)毒素濃度點λ1=0.0312 Eu/mL,陰性合格。供試品等比稀釋液中,1∶20稀釋液的回收率為216.7%,說明該稀釋液對鱟試劑有增強作用。1∶40、1∶80、1∶160稀釋液的回收率均在50%~200%之間,符合中國藥典規(guī)定。1∶80稀釋液的回收率接近100%,最接近真實值,在日常檢查中,選1∶80稀釋液為宜。 2.3.3 干擾實驗 另取3批痰熱清注射液,用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋為1∶80稀釋液,作為供試品空白管,記為A液。同時分別取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為2 λm和供試品1∶40稀釋液,在稀釋用試管中等量混合,得作為供試品陽性管,記為B液。分別取兩批鱟試劑進(jìn)行試驗。分別取上述溶液各0.2mL加入預(yù)先加有0.1 mL動態(tài)濁度法鱟試劑反應(yīng)管內(nèi),混合均勻。立即插入BET32B型細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀進(jìn)行自動檢測,其中每一濃度做2支平行管,并同時做2支陰性對照管(NC)。結(jié)果見表3。表3 干擾實驗結(jié)果(略) 結(jié)果可見,陰性對照內(nèi)毒素小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低內(nèi)毒素濃度點λ1=0.0312 Eu/mL,陰性合格。供試品1∶80稀釋液的回收率均在50%~200%之間,則該稀釋液對鱟試劑反應(yīng)無干擾作用。 2.4 定量檢查 根據(jù)以上干擾實驗結(jié)果,對4批痰熱清注射液以1∶80稀釋液進(jìn)行定量檢查。結(jié)果見表4。表4 定量檢查結(jié)果(略) 3 討論 痰熱清注射液為中藥制劑,其成分較復(fù)雜,故細(xì)菌內(nèi)毒素限值應(yīng)從嚴(yán)考慮。本法結(jié)合臨床實際用藥及考慮葡萄糖注射液的加和性,確保細(xì)菌內(nèi)毒素限值安全、可靠。 在實驗中采取熱原法和動態(tài)濁度法在相同實驗條件下同時測定,兩種實驗方法得到一致的結(jié)果,符合中國藥典對細(xì)菌內(nèi)毒素實驗成立的規(guī)定。動態(tài)濁度法定量進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測具有操作簡便,結(jié)果準(zhǔn)確,檢測靈敏度高,減少人為誤差,幫助分析干擾情況和可以觀察反應(yīng)過程等優(yōu)點。 【參考文獻(xiàn)】
作者:林穎,陳華龍 作者單位:韶關(guān)學(xué)院醫(yī)學(xué)院,廣東韶關(guān) 512026 |
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