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| 購(gòu)買(mǎi)進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 m.kjhfd.cn |
鱟試劑是從棲生于海洋的節(jié)肢動(dòng)物“鱟”的蘭色血液中提取變形細(xì)胞溶解物，經(jīng)低溫冷凍干燥而成的生物試劑，專(zhuān)用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)。 鱟試驗(yàn)法是國(guó)際上至今為止檢測(cè)內(nèi)毒素最好的方法，它簡(jiǎn)單﹑快速﹑靈敏﹑準(zhǔn)確，因而被歐美藥典及我國(guó)藥典定為法定內(nèi)毒素檢查法，并已被世界各國(guó)所采用。
目前國(guó)際上銷(xiāo)售的鱟試劑有兩種，一種稱美洲鱟試劑（Limulus Amebocyte Lysate），縮寫(xiě)為L(zhǎng)AL，由美國(guó)生產(chǎn)；另一種稱東方鱟鱟試劑（Tachypleus Amebocyte Lysate），縮寫(xiě)為T(mén)AL。實(shí)驗(yàn)證明：美洲鱟試劑-LAL比東方鱟試劑LAL更純潔，檢測(cè)效果更好。
TAL檢查內(nèi)毒素有很多方法，目前應(yīng)用最廣泛的是凝膠法，此外還有動(dòng)態(tài)濁度法﹑顯色基質(zhì)法,比色法等。其用途有以下幾方面：1. 藥檢：用于注射藥品﹑放射性藥物﹑生物制品﹑注射器及生產(chǎn)工藝流程中的內(nèi)毒素檢測(cè)；2. 臨床：用于檢測(cè)病人各種體液中的內(nèi)毒素含量；3. 其他：用于檢測(cè)水或食品中的內(nèi)毒素含量。
2005年版中國(guó)藥典 《細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法-鱟試劑法》(鱟試劑－LAL法)
本法系利用鱟試劑來(lái)檢測(cè)或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。
細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測(cè)定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測(cè)時(shí)，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)測(cè)定結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。
細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位（EU）表示。
細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品系自大腸桿菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)。
細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系以細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價(jià)，用于試驗(yàn)中鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗(yàn)及設(shè)置的各種陽(yáng)性對(duì)照。
凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水。定量測(cè)定用的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，其內(nèi)毒素的含量應(yīng)小于0.005EU/ml。
試驗(yàn)所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。常用的方法是在250℃干烤至少30分鐘，也可用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無(wú)內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾的器械。試驗(yàn)操作過(guò)程應(yīng)防止微生物的污染。
供試品溶液的制備 某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的PH值在6.0-8.0的范圍內(nèi)。對(duì)于過(guò)酸、過(guò)堿或本身有緩沖能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測(cè)溶液（或其稀釋液）的PH值，可使用酸、堿溶液或鱟試劑生產(chǎn)廠家推薦的適宜的緩沖劑調(diào)節(jié)PH值。酸或堿溶液須用檢查用水在已去除內(nèi)毒素的容器中進(jìn)行配制。緩沖液必須經(jīng)過(guò)驗(yàn)證不含內(nèi)毒素和干擾因子。
內(nèi)毒素限值的建立 藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）一般按以下公式確定：
L=K/M
式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性單位）表示；
K為人每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/(kg·h)表示，注射劑K=5E U/(kg·h)，放射性藥品注射劑K=2.5 EU/(kg·h)，鞘內(nèi)用注射劑K=0.2 EU/(kg·h)。
M為人用每公斤體重每小時(shí)最大劑量，以ml(kg·h)、mg (kg·h)或U/ (kg·h)表示，人均體重按60kg計(jì)算，注射時(shí)間若不足1小時(shí)，按1小時(shí)計(jì)算。
按人用劑量計(jì)算限值時(shí)，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實(shí)際情況做必要調(diào)整，但需說(shuō)明理由。
確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD） 最大有效稀釋倍數(shù)是指供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過(guò)此稀釋倍數(shù)下可進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測(cè)。用以下公式來(lái)確定MVD：
MVD=CL/λ
式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值；
C為供試品溶液的濃度，當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，則C等于1.0ml/ml，當(dāng)L以EU/mg或EU/U表示時(shí)，C的單位需為mg/ml或U /ml。如供試品為注射用無(wú)菌粉末或原料藥，則MVD取1，計(jì)算供試品的最小有效濃度C=λ/L。
λ為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（EU/ml），或是在光度測(cè)定法中所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低的內(nèi)毒素濃度。
方法1 凝膠法
凝膠法系通過(guò)鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來(lái)檢測(cè)或半定量?jī)?nèi)毒素的方法。在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，用EU/ml表示。
鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn) 當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。
根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值（λ），將細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒鐘。取含有分裝了0.1ml鱟試劑溶液的10mm×75mm試管或復(fù)溶后的0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加入0.1ml不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，及每一個(gè)濃度平行做4管；另外2管加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37℃±1℃適宜恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。
將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°時(shí)，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽(yáng)性；形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形或從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過(guò)程應(yīng)避免受到振動(dòng)造成假陰性結(jié)果。
若最大濃度2λ管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對(duì)照管為陰性，試驗(yàn)方為有效。按下式計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測(cè)定值(λc).
λc=1g-1(∑X/4)
式中X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（1g）。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度。
當(dāng)λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。
干擾試驗(yàn) 按表1制備溶液A、B、C和D，使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗(yàn)出內(nèi)毒素且不超過(guò)最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液，按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。
只有當(dāng)溶液A和陰性對(duì)照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果在鱟試劑靈敏度復(fù)核范圍內(nèi)時(shí)，試驗(yàn)方為有效。按下式計(jì)算C和B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es和Et）。
Es= 1g-1(∑Xs/4)
Et= 1g-1(∑Xt/4)
式中Xs、Xt分別為系列溶液C和溶液B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（1g）。
當(dāng)Es在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es-2Es (包括0.5 Es和2 Es)時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無(wú)干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對(duì)試驗(yàn)有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)行不超過(guò)MVD的進(jìn)一步稀釋?zhuān)僦貜?fù)干擾試驗(yàn)。
表1 凝膠法干擾試驗(yàn)溶液的制備
注：A 供試品溶液；B干擾試驗(yàn)系列；C鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對(duì)照系列；D陰性對(duì)照。
可通過(guò)對(duì)供試品進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋或通過(guò)其他適宜的方法（如過(guò)濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效的排除干擾且不會(huì)使內(nèi)毒素失去活性，要使用預(yù)先添加了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再經(jīng)過(guò)處理的供試品溶液進(jìn)行干擾試驗(yàn)。
當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前，或無(wú)內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的品種建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。
當(dāng)鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。
檢查法
1）凝膠限量試驗(yàn)
按表2制備溶液A、B、C、D。使用稀釋倍數(shù)為MVD并且已經(jīng)排除干擾的供試品溶液來(lái)制備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。
表2 凝膠限量試驗(yàn)溶液的制備
注：A供試品溶液；B供試品陽(yáng)性對(duì)照；C陽(yáng)性對(duì)照；D陰性對(duì)照。
結(jié)果判斷 保溫60分鐘±2分鐘后觀察結(jié)果。若陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽(yáng)性對(duì)照B的平行管均為陽(yáng)性，陽(yáng)性對(duì)照溶液C的平行管均為陽(yáng)性，試驗(yàn)有效。
若溶液A的兩個(gè)平行管都為陰性，判供試品符合規(guī)定；若溶液A的兩個(gè)平行管均為陽(yáng)性，判供試品不符合規(guī)定。若溶液A的兩個(gè)平行管中的一管為陽(yáng)性另一管為陰性，需進(jìn)行復(fù)試。復(fù)試時(shí)，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判供試品符合規(guī)定；否則判供試品不符合規(guī)定。
2）凝膠半定量試驗(yàn)
本方法系通過(guò)確定反應(yīng)終點(diǎn)濃度來(lái)量化供試品中內(nèi)毒素的含量。依表3制備溶液A、B、C和D。按鱟度劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。
結(jié)果判斷 若陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽(yáng)性對(duì)照B的平行管均為陽(yáng)性，系列溶液C的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值在0.5λ-2λ之間，試驗(yàn)有效。
系列溶液A中每一系列平行管的終點(diǎn)稀釋倍數(shù)乘以λ，為每個(gè)系列的反應(yīng)終點(diǎn)濃度，所有平行管反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內(nèi)毒素濃度（按公式CE=1g-1(∑X/2)）。如果試驗(yàn)時(shí)采用的是供試品的稀釋液，則計(jì)算原始溶液內(nèi)毒素濃度時(shí)要將結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)。
如試驗(yàn)中供試品溶液的結(jié)果都為陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于λ（如果檢驗(yàn)的是稀釋過(guò)的供試品，則記錄為小于λ乘以該供試品的最低稀釋倍數(shù)）。如果結(jié)果都為陽(yáng)性，應(yīng)記為內(nèi)毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以λ。
若內(nèi)毒素濃度小于規(guī)定的限值，判供試品符合規(guī)定。若內(nèi)毒素濃度大于或等于規(guī)定的限值，判供試品不符合規(guī)定。
表3 凝膠半定量試驗(yàn)溶液的制備
注：A：沒(méi)有超過(guò)MVD并且通過(guò)干擾試驗(yàn)的供試品溶液。用檢查用水進(jìn)行2倍系列稀釋?zhuān)瑥耐ㄟ^(guò)干擾試驗(yàn)的稀釋倍數(shù)開(kāi)始再稀釋至1倍、2倍、4倍和8倍，但隨后的稀釋也不得超過(guò)MVD；
B：含2λ濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的溶液A（供試品陽(yáng)性對(duì)照）；
C：含2λ、1λ、0.5λ和0.25λ濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的檢查用水系列；
D：陰性對(duì)照。
方法2 光度測(cè)定法
光度測(cè)定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法。
濁度法系利用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過(guò)程過(guò)程中的濁度變化而測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測(cè)原理，可分為終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法。終點(diǎn)濁度法是依據(jù)反映混合物中的內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)的濁度（吸光度和透光率）之間存在著量化關(guān)系來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)濁度法是檢測(cè)反應(yīng)混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間，或是檢測(cè)濁度增加速度的方法。
顯色基質(zhì)法系利用鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物顯色釋放出的呈色團(tuán)的多少而測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測(cè)原理，分為終點(diǎn)顯色法和動(dòng)態(tài)顯色法。終點(diǎn)顯色法是依據(jù)反應(yīng)混合物中內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)釋放出的有色團(tuán)的量之間存在著量化關(guān)系來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)顯色法是檢測(cè)反應(yīng)混合物的色度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間，或是檢測(cè)色度增長(zhǎng)速度的方法。
光度測(cè)定試驗(yàn)應(yīng)在特定的儀器中進(jìn)行，溫度一般為37℃±1℃。
供試品和鱟試劑的加樣量、供試品和鱟試劑的比例以及保溫時(shí)間等，參照所用儀器和試劑的有關(guān)說(shuō)明進(jìn)行。
為保證濁度和顯色試驗(yàn)的有效性，應(yīng)預(yù)先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)以及供試品溶液的干擾試驗(yàn)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn) 當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)。
用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素配成溶液，并制成至少3個(gè)濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于10），最低濃度不得低于所用鱟試劑的標(biāo)示檢測(cè)限。每一稀釋步驟的混勻時(shí)間同凝膠法，每一濃度至少做3支平行管。同時(shí)要求做2支陰性對(duì)照。當(dāng)陰性對(duì)照在設(shè)定的時(shí)間內(nèi)不發(fā)生反應(yīng)，將全部數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析。
根據(jù)線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r）的絕對(duì)值應(yīng)該大于或等于0.980，試驗(yàn)方為有效。否則須重新試驗(yàn)。
干擾試驗(yàn) 選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度。按表4制備溶液A、B、C和D。每種溶液至少做2個(gè)平行管。
表4 光度測(cè)定法干擾試驗(yàn)的制備
注 A：稀釋倍數(shù)未超過(guò)MVD的供試品溶液。
B：加入標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或靠近中點(diǎn)的一個(gè)已知內(nèi)毒素濃度的，且與溶液A有相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液。
C：如“標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)”項(xiàng)下描述的，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液。
D：陰性對(duì)照。
按所得線性回歸方程分別計(jì)算供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量Ct和Cs，再按下式計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率（R）。
R=(CS-Ct)/λm×100%
當(dāng)內(nèi)毒素的回收率在50%~200%之間，則認(rèn)為在此該試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。
當(dāng)內(nèi)毒素的回收率不在指定的范圍時(shí)，須按“凝膠法干擾試驗(yàn)”中的方法去除干擾因素。并要重復(fù)干擾試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證處理的有效性。
當(dāng)鱟試劑、供試品的來(lái)源、配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。
檢查法
按“光度法的干擾試驗(yàn)”中的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。
使用溶液C生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算溶液A的每一平行管的內(nèi)毒素濃度。
試驗(yàn)必須符合以下三個(gè)條件方為有效：
（1）系列溶液C的結(jié)果要符合 “標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)”中的要求。
（2）用溶液B中的內(nèi)毒素濃度減去溶液A中的內(nèi)毒素濃度后，計(jì)算出的內(nèi)毒素的回收率要在50%-200%的范圍內(nèi)。
（3）溶液D在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)不發(fā)生反應(yīng)。
若供試品溶液所在平行管的平均內(nèi)毒素濃度乘以稀釋倍數(shù)和濃度后，小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品符合規(guī)定。若大于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品不符合規(guī)定。
（注：本檢查法中，“管”的意思包括其他任何反應(yīng)容器，如微孔板中的孔。）
美國(guó)藥典USP24版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法(鱟試劑－LAL法)
本文是USP24細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（BACTERLAL ENDOTOXINS TEST）的譯文，但目前執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)是USP24版第二增補(bǔ)本（USP—NF19 Second Supplement）的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，讀者可對(duì)照學(xué)習(xí)，從中可看出USP24細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的不足之處。本文將介紹用鱟試劑檢測(cè)樣品內(nèi)或樣品上存在的細(xì)菌內(nèi)毒素濃度的方法。鱟試劑（Limulus Amebocyte,LAL）來(lái)自鱟的循環(huán)細(xì)胞，經(jīng)水提取而行，制備和檢驗(yàn)后，用于凝固法。
反應(yīng)的終點(diǎn)是將供檢樣品稀釋后，與平行稀釋的參考內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行直接比較得到的。測(cè)得的內(nèi)毒素含量用規(guī)定的內(nèi)毒素單位表示。
鱟試劑也是用濁度法或顯色法來(lái)讀取數(shù)據(jù)的，這些試齊只要能滿足這些選擇方法的要求，就可以使用。在做試驗(yàn)時(shí)，需要先做出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用該曲線計(jì)算供檢樣品的內(nèi)毒素含量，包括樣品和對(duì)照液加鱟試劑后的培育時(shí)間和在分光光度計(jì)上讀取光密度時(shí)使用的波長(zhǎng)等操作，都應(yīng)該事先規(guī)定好。如果是終點(diǎn)濁度法，則到達(dá)培育期后，應(yīng)立刻讀取讀數(shù)。而動(dòng)力學(xué)檢測(cè)（兇手濁度法和顯色法），光密度的測(cè)定是貫穿于整個(gè)反應(yīng)期間，而用于計(jì)算結(jié)果的百分?jǐn)?shù)就是從這些讀數(shù)中計(jì)算出來(lái)的。在用終點(diǎn)法的顯色法檢測(cè)時(shí)，在到達(dá)事先規(guī)定的反應(yīng)時(shí)間后，添加停止酶反應(yīng)的試劑使反應(yīng)停止后，再讀取數(shù)據(jù)。
1、參考內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)與對(duì)照內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)
參考內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)（Reference standard endotoxin,RSE）是美國(guó)藥典（USP）的內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)，其效價(jià)為每瓶10 000個(gè)USP內(nèi)毒素單位（EU）。每瓶參考內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)加5ml鱟試劑用水（LAL Reagent Watet），用旋轉(zhuǎn)攪拌器間歇攪拌30min使其溶解，制成原液，用這一原液制作合適的系列稀釋。原液應(yīng)保存于冰箱中，用于以后的稀釋?zhuān)４鏁r(shí)間不得超過(guò)14d。用前，用旋轉(zhuǎn)攪拌器強(qiáng)力攪拌至少3min，每一步稀釋?zhuān)辽贁嚢?0s，然后才能用它稀釋下一步。經(jīng)稀釋的參考內(nèi)毒素不得貯存待以后使用，因?yàn)槲阶饔脮?huì)使其失去活性。對(duì)照內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)（Contuol standard endotoxin,CSE）是以參考內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)另行制備的。一批新的對(duì)照內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)在使用前應(yīng)進(jìn)行檢定。檢定時(shí)使用的鱟試劑應(yīng)為試驗(yàn)中使用的同批鱟試劑。參考內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢定時(shí)，可使用鱟試劑的凝固法，按“試驗(yàn)操作”進(jìn)行。每批對(duì)照內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)，至少取1瓶與1瓶參考內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比。參考內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)的每個(gè)稀釋度作4管。每瓶或每個(gè)樣品的對(duì)照內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)的每個(gè)稀釋度也都要4管。參考內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)的對(duì)數(shù)Log10的平均值和對(duì)照內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)的對(duì)數(shù)Log10平均值之間的差值的反對(duì)數(shù)等于對(duì)照內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)效價(jià)的標(biāo)定值?？筛鶕?jù)情況，將其變換成每ng干燥制劑的單位數(shù)或每瓶所含的單位數(shù)。
適宜的對(duì)照內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)的效價(jià)應(yīng)不小于2EU/ng也不大于50EU/ng。
2、試驗(yàn)的準(zhǔn)備
鱟試劑的靈敏度應(yīng)經(jīng)過(guò)確證。試驗(yàn)中使用的所有容器和用具，都必須在≥250℃的烤箱中，用足夠的時(shí)間進(jìn)行加熱處理、破壞這些用具表面上可能存在的外源性內(nèi)毒素。
內(nèi)毒素試驗(yàn)的結(jié)果是否可靠，還必須從試驗(yàn)使用的各種用具、溶液、洗滌用品中取樣或提取樣品，并用適當(dāng)?shù)姆椒ㄗC明它們對(duì)反應(yīng)沒(méi)有抑制或拉強(qiáng)或其它干擾作用?？砂聪率龇椒ㄟM(jìn)行抑制試驗(yàn)或增強(qiáng)試驗(yàn)。試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照。如果鱟試劑的原材料、生產(chǎn)方法或處方發(fā)生改變時(shí)都要重新進(jìn)行試驗(yàn)。
3、鱟試劑靈敏度的確認(rèn)試驗(yàn)
為了確認(rèn)鱟試劑標(biāo)簽上的靈敏度，每批至少取1瓶樣品進(jìn)行檢定。參考內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)（或?qū)φ諆?nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)）作2倍系列稀釋?zhuān)♂尦?.0λ,1.0λ,0.5λ和0.25λ。其中λ是鱟試劑標(biāo)簽上的靈敏度EU/ml。
上述4個(gè)稀釋度和陰性對(duì)照都要重復(fù)做4管。所得結(jié)果的幾何平均值的對(duì)數(shù)應(yīng)大于或等于0.5λ，小于或等于2.0λ。每一批新的鱟試劑，使用前都必須作標(biāo)簽靈敏度的確認(rèn)試驗(yàn)。
4、抑制試驗(yàn)和增強(qiáng)試驗(yàn)
用不超過(guò)地大有效稀釋而檢測(cè)不出內(nèi)毒素的樣品，不加或內(nèi)毒素，使最后濃度等于2.0λ,1.0λ,0.5λ和0.25λ。按照試驗(yàn)操作（Test Procedure）項(xiàng)的規(guī)定用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素進(jìn)行檢定。不加和加內(nèi)毒素的樣品管至少做4管。同時(shí)，用水稀釋上述相同濃度的內(nèi)毒素和陰性對(duì)照各兩管，做平行兩管試驗(yàn)。按照計(jì)算和判定項(xiàng)的方法，計(jì)算樣品終點(diǎn)內(nèi)毒素濃度的幾何平均值。
如果所得結(jié)果大于或等于0.5λ，小于或等于2.0λ,則該樣品適合作細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。
用中和、滅活或除去干擾物質(zhì)方法或用不超過(guò)最大有效稀釋度稀釋檢品后，可重做抑制試驗(yàn)和增強(qiáng)試驗(yàn)。如果用不超過(guò)最大有效稀釋法，對(duì)已知加量的內(nèi)毒素可以克服抑制和增強(qiáng)作用。則樣品可以經(jīng)過(guò)稀釋后，再作內(nèi)毒素檢查。
如果在試驗(yàn)條件下，對(duì)未處理的樣品檢查出有內(nèi)源性內(nèi)毒素。則該樣品不適合用于作抑制或拉強(qiáng)試驗(yàn)。不過(guò)，這種樣品可用超過(guò)濾法將存在的內(nèi)毒素去掉或做適當(dāng)稀釋、使之適合于作抑制或增強(qiáng)試驗(yàn)。稀釋未處理樣品（像開(kāi)瓶溶解或在使用前注射前稀釋那樣），稀釋到檢驗(yàn)不到內(nèi)毒素但不超過(guò)最大有效稀釋倍數(shù)。再用這些已稀釋的樣品重作抑制試驗(yàn)或增強(qiáng)試驗(yàn)。
5、最大有效稀釋度（MVD）
最大有效稀釋度是指在使用時(shí)將藥物溶解或稀釋成恰好用于注射或其它非經(jīng)口途徑使用的濃度。有時(shí)為了避免給藥量的體積（EU/ml）計(jì)算。用試劑標(biāo)簽上的靈敏度（EU/ml）λ除限定濃度，就可以得到MVD因子。如果某一試劑的限量濃度是按重量或按藥品的活性單位計(jì)算（EU/mg或EU/單位）。用限量乘藥品在溶液中的濃度，或按標(biāo)簽說(shuō)明稀釋成的濃度（mg/ml或單位/ml）,再除的λ，就可以得到MVD因子是準(zhǔn)備試驗(yàn)而使試驗(yàn)有效的限定稀釋因子。
6、試驗(yàn)操作
在準(zhǔn)備和進(jìn)行試驗(yàn)的過(guò)程中，必須十分注意，避免使樣品受到大量的細(xì)菌污染。為了定量檢測(cè)樣品中的內(nèi)毒素含量，常用系列稀釋法稀釋樣品。用幾何稀釋法，使每上一步稀釋較下一步稀釋成為定比關(guān)系。試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照和陽(yáng)性產(chǎn)品對(duì)照。
供試的每一個(gè)樣品的每一步系列稀釋?zhuān)辽僖鲋貜?fù)性2管。標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的系列稀釋?xiě)?yīng)包括至少兩個(gè)重復(fù)管。每一個(gè)框架的試管中都必須有一組標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的系列稀釋管。只要每一個(gè)框架的環(huán)境條件是均一的，一個(gè)框架中可以由幾個(gè)試管架組成。
（1）準(zhǔn)備：標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素以及鱟試劑的形狀與裝量，各個(gè)廠家不盡相同。因此，溶解和稀釋必須按標(biāo)簽的說(shuō)明進(jìn)行。樣品和鱟試劑混合物的pH，除另有規(guī)定外，必須位于6.0—8.0之間。樣品的pH在試驗(yàn)前，可添加滅菌的無(wú)內(nèi)毒素污染的氫氧化鈉、鹽酸或適宜的緩沖液調(diào)整。
（2）操作：取若干10mm×75mm試管或單個(gè)的試驗(yàn)管。每管加適量的陰性對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素、樣品和陽(yáng)性產(chǎn)品對(duì)照。陽(yáng)性產(chǎn)品對(duì)照由鱟試劑、洗液或提取液添加2.0λ濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素置中，準(zhǔn)確記錄試管的放置時(shí)間、于37℃±1℃，放置60min±2min,輕輕地取出觀察。形成結(jié)實(shí)的凝膠，翻轉(zhuǎn)180°，停留于原處不動(dòng)者為陽(yáng)性，記（+）號(hào)。不形成凝膠或形成的凝膠不結(jié)實(shí)，則判為陰性、記（-）號(hào)。拿取試管時(shí)，要輕拿輕放，避免不必要的碰撞，而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。如果陽(yáng)性產(chǎn)品對(duì)照呈陰性或內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)的濃度不落在鱟試劑標(biāo)簽靈敏度2倍稀釋的±1之間，或任何陰性對(duì)照出現(xiàn)陽(yáng)性，試驗(yàn)應(yīng)判為無(wú)效。然后計(jì)算樣品中的內(nèi)毒素含量。
7、計(jì)算和判定
（1）幾何平均值的計(jì)算：系列稀釋最后的陽(yáng)性管為樣品或樣品加內(nèi)毒素管的終點(diǎn)。記錄每管的終點(diǎn)濃度E，換算成對(duì)數(shù)終點(diǎn)濃度e，用下列公式計(jì)算終點(diǎn)的幾何平均濃度：
終點(diǎn)的幾何平均濃度=log-1(Σe/f)
其中Σe為各稀釋度對(duì)數(shù)終點(diǎn)之和；f為各稀釋度的重復(fù)管安數(shù)。
（2）內(nèi)毒素含量計(jì)算：計(jì)算被檢樣品中或被檢樣品上的內(nèi)毒素含量（EU/ml，EU/g或EU/mg）時(shí)，首先計(jì)算出終點(diǎn)濃度E，再乘以稀釋因子λ（λ為鱟試劑標(biāo)簽注明的靈敏度）。被檢樣品的幾何平均濃度等于Σe/f的反對(duì)數(shù)，其中e等于終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)，f為被檢樣品該稀釋度的重復(fù)管數(shù)。
（3）結(jié)果判定：如果內(nèi)毒素含量小于該品種規(guī)定的含量界限，則該品種符合規(guī)定。
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