檢測任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇，為縮小抗體的選擇范圍選中合適的抗體，需要考慮如下幾種因素：試驗(yàn)應(yīng)用的類型、樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)、樣本的種屬、抗體宿主的種類、抗體的標(biāo)記和檢測。具體分析如下：
1.分析試驗(yàn)應(yīng)用的類型
一般抗體說明書都列出該抗體經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證過適用于何種分析類型，如：可以應(yīng)用于WB IHC ICC ELASA分析等，如果抗體說明書沒有提及的應(yīng)用類型，并不意味著該抗體不適用于此種分析應(yīng)用類型，而僅是說明尚未經(jīng)過此種分析試驗(yàn)驗(yàn)證，如果抗體不適用某些分析試驗(yàn)，則會在抗體說明書上標(biāo)注出來不適于某分析試驗(yàn)。
2.樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)
了解樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有助于選擇最合適的抗體，至少兩方面因素需要考慮
?待測樣本蛋白的結(jié)構(gòu)域：抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來，其中的免疫原包括：全長蛋白、蛋白片斷、多肽、全有機(jī)體（如：細(xì)菌）或細(xì)胞，抗體說明書一般都有免疫原的描述，如果打算檢測的是蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長的某一區(qū)域，則必須選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。如果打算用FACS流式檢測活細(xì)胞的表面蛋白，則需要選擇含該表面蛋白的胞外域來免疫制備的抗體。
?樣本的提取或處理過程：某些抗體要求樣本經(jīng)過某些特殊處理，例如：許多抗體只識別還原和變性的、表位已暴露不受二級四級結(jié)構(gòu)阻礙的蛋白樣本，另一方面，某些抗體僅識別天然折疊狀態(tài)的蛋白。當(dāng)選擇免疫組化的抗體時(shí)，應(yīng)注意某些抗體只識別未固定的冷凍的組織，而另一些抗體則適用于無需抗原修復(fù)解交聯(lián)步聚的甲醛固定石蠟包埋的組織，這些都會在抗體說明書上應(yīng)用部分標(biāo)示出來
3.樣本的物種
應(yīng)選擇物種相同或有交叉反應(yīng)的抗體，抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有交叉反應(yīng)，因其氨基酸序列同源性較高，如果樣本的種類未列入抗體說明書上的交叉反應(yīng)種屬表中，并不意味著該抗體不適用于檢測該物種的蛋白，而只是表示該物種尚未用此抗體檢測驗(yàn)證過，應(yīng)通過序列比對的方法來預(yù)測交叉反應(yīng)，可應(yīng)用Expasy 和 NCBI BLAST來進(jìn)行不同物種蛋白同源性比對。
4.一抗宿主物種的選擇
一般說來，在使用偶聯(lián)二抗結(jié)合無偶聯(lián)物的一抗時(shí)，一抗宿主動(dòng)物的物種選擇較為重要，對于免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)，例如：檢測小鼠樣本蛋白，則不應(yīng)選擇小鼠或大鼠源的一抗，最好選兔源的一抗，則二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔IgG。如果選擇有偶聯(lián)物的一抗則不適用上述情況，除免疫組化外的其它對不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣本的檢測方法，則抗體宿主物種的影響不大，如對不含IgG的細(xì)胞裂解物樣本的western blotting檢測，盡管如此，含有血清的組織裂解物和組織培養(yǎng)上清中含有免疫球蛋白，還原變性樣本中含IgG，在western blot檢測中則結(jié)合出現(xiàn)IgG分子50 ａnd 25 kDa的重鏈和輕鏈條帶。
5.二抗的選擇
二抗應(yīng)選用與使用的一抗相同的物種來源，例如：如果你的一抗是小鼠的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗anti-mouse secondary。建議檢查二抗說明書確保該抗體適用于你的檢測應(yīng)用， 二抗一般連接熒光素FITC或發(fā)光團(tuán)。
6.雙重染色抗體的選擇
用未偶聯(lián)一抗進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)物或組織切片的雙重免疫染色要求一抗來源于不同物種并且二抗分別識別其中之一，二抗說明書應(yīng)描述其與其它物種來源的免疫球蛋有否有交叉吸附。
7.熒光和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記
連接于二抗的標(biāo)記物是為了檢測抗體的結(jié)合，選擇標(biāo)記物依賴于幾個(gè)參數(shù)：
檢測方法：
熒光或著色沉淀，熒光標(biāo)記物用特殊波長的光激發(fā)時(shí)發(fā)射出可見光
?封片介質(zhì)：AEC, Fast Red, INT 或其它水性發(fā)光基團(tuán)是可以醇溶的并要求水性封片. 除上述之外的發(fā)光基團(tuán)是有機(jī)的所以最好使用有機(jī)性封片介質(zhì)。熒光素標(biāo)記物要求水性封片介質(zhì)，藻紅蛋白（藻青素 / 藻紅素要求不添加甘油的水性封片介質(zhì)，因其有淬滅熒光的效應(yīng)
生物素化的抗體：通常用于加強(qiáng)親和素-生物素-酶或熒光素復(fù)合物
