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| 購買進(jìn)口儀器、試劑和耗材——就在始于2001年的畢特博生物 m.kjhfd.cn |
1、什么是活體電穿孔 活體電穿孔法(in vivo electroporation) 是將外源基因通過電場(chǎng)作用，導(dǎo)入動(dòng)物目標(biāo)組織或器官。由于這種方法能有效導(dǎo)入外源基因，可在多種組織器官上應(yīng)用,并且效率較高?；铙w電穿孔法的原理很簡單,在直流電場(chǎng)作用的瞬間,細(xì)胞膜表面產(chǎn)生疏水或親水的微小通道105～115μm ,這種通道能維持幾毫秒到幾秒,然后自行恢復(fù)。在此期間生物大分子如DNA 可通過這種微小的通道進(jìn)入細(xì)胞 。近年來活體電穿孔法用于轉(zhuǎn)基因研究的報(bào)道不斷增多,在基因治療方面的優(yōu)勢(shì)也日趨顯著,是一種很好的活體基因?qū)敕椒ā?/P> 活體電穿孔法可用于檢測(cè)瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中載體的表達(dá)狀況。大量的研究表明活體電穿孔法在基因治療方面有非常好的應(yīng)用前景。因此目國內(nèi)外對(duì)活體電穿孔法介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)移的研究越來越多。 2、活體電穿孔的法的特點(diǎn) 活體電穿孔法基因?qū)牒捅磉_(dá)效率較高,它的特點(diǎn)主要在以下幾個(gè)方面: 首先,靶器官的選擇面廣,理論上任何組織和器官都可以作為活體電穿孔的靶器官。 在用于基因治療方面，要考慮到靶器官組織生理特性。如果所選擇的局部組織細(xì)胞不能把所轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)產(chǎn)物分泌到外周血液循環(huán)中,則在某種意義上說已失去了基因?qū)氲膬r(jià)值,這在基因治療中是關(guān)鍵性的問題。當(dāng)使用組織特異性表達(dá)載體時(shí),研究人員應(yīng)根據(jù)所構(gòu)建的表達(dá)載體來選擇基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的靶器官組織。例如魚精蛋白21 啟動(dòng)子可指導(dǎo)外源基因在精母細(xì)胞中特異性表達(dá),以小鼠的睪丸作為靶器官將含有魚精蛋白21啟動(dòng)子的表達(dá)載體導(dǎo)入,獲得外源基因的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于該基因在肝臟和骨骼肌中的表達(dá)。 其次,對(duì)導(dǎo)入的外源基因片段的大小沒有限制,從幾KB 或十幾KB 的表達(dá)載體, 到100～200KB 的YAC、BAC 基因組,都有成功導(dǎo)入并獲得表達(dá)的報(bào)道。 此外活體電穿孔法操作簡單快速,電穿孔的時(shí)間只有幾秒鐘,而且DNA片段不需要特殊的純化操作。 但電穿孔法也存在一些的缺點(diǎn):首先,外源基因表達(dá)持續(xù)的時(shí)間很短,雖然外源基因?qū)牒笞羁炜稍?15 小時(shí)有表達(dá),但大多1～2 月后表達(dá)量降至很低。外源基因表達(dá)的時(shí)間主要由于所構(gòu)建的表達(dá)載體和基因?qū)氲陌屑?xì)胞組織器官不同而存在巨大差異。 由于應(yīng)用不同的表達(dá)載體,Muramatsu 在小鼠肝臟進(jìn)行電穿孔7天后則檢測(cè)不到外源基因的表達(dá),而Heller 21 天后還可以檢測(cè)到外源基因的表達(dá)。如果選擇代謝和酶活動(dòng)旺盛的組織器官如肝臟,則表達(dá)持續(xù)時(shí)間會(huì)較短,表達(dá)時(shí)間在1 個(gè)月以內(nèi),但以骨骼肌為靶組織,表達(dá)可持續(xù)15個(gè)月。 3、 活體電穿孔法與其他活體基因?qū)敕椒ǖ谋容^ 到目前為止,非病毒載體的活體基因?qū)敕椒ㄓ兄苯幼⑸浞?、脂質(zhì)體法、基因槍法、電穿孔法等。每一種方法都有其各自的特殊性,因此很難將這幾種方法進(jìn)行簡單的比較。 直接注射法：可將外源基因直接注射到靶位點(diǎn)或血管中,但此種方法不適合以肌肉作為靶器官,它的外源基因表達(dá)效率極低,僅為電穿孔法的百分之一。 脂質(zhì)體法：活體基因轉(zhuǎn)移法中脂質(zhì)體法更適宜較大面積組織的基因?qū)?但無法避免DNA濃度變低,在出血的情況下會(huì)使本來不高的DNA濃度更加降低,往往造成基因?qū)胄实汀?/P> 基因槍法：適合于DNA較易接觸到的質(zhì)地較堅(jiān)韌的組織如皮膚,而視網(wǎng)膜、胚胎和禽類的胚盤等組織會(huì)由于機(jī)械刺激和出血造成器質(zhì)性損傷或發(fā)育停滯,因而不能用基因槍法完成。DNA包裹的金屬顆粒從基因槍發(fā)出到達(dá)組織表面大多只幾百微米的距離,較深層的組織不易操作, 表達(dá)效率也較低。 Muramatsu報(bào)道在材料一致的情況下,電穿孔法的基因?qū)牒捅磉_(dá)效率明顯高于其它方法,而且電穿孔法適合多種組織的操作［3 ］ 。 4 活體電穿孔法施加條件的研究 波型的選擇 在電穿孔過程中方波較指數(shù)衰減波更能獲得較高的基因表達(dá)。同時(shí)方波只要要求控制電壓和時(shí)間，十分直觀，而指數(shù)衰減波需要控制的電壓、電容、電阻等參數(shù)，這樣的條件摸索過程中，方波較指數(shù)衰減波更易得到高表達(dá)。 電 壓 電穿孔時(shí)在能量導(dǎo)入一定的情況下設(shè)計(jì)施加電壓的值。電壓過低或過高都會(huì)影響外源基因的表達(dá)。電壓過低時(shí),無法造成細(xì)胞膜表面狀態(tài)的改變,因而外源D不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。電壓過高時(shí),局部組織積聚過多熱量,造成細(xì)胞的死亡或組織失去功能,即使外源基因?qū)爰?xì)胞,也無法進(jìn)行正常的表達(dá)。哺乳動(dòng)物常用的活體電壓大多為20～100VPcm ,最高電壓在250～750VPcm。 電穿孔次數(shù)和時(shí)間 有試驗(yàn)證明,皮膚的電阻在每一次電穿孔后都有所降低，說明電穿孔使皮下組織形成孔道,且其大小隨電穿孔而變大,經(jīng)過電穿孔的處理后外源基因更易在更深的真皮和毛囊內(nèi)表達(dá)。但電穿孔次數(shù)不能過多,否則會(huì)對(duì)局部的細(xì)胞組織造成不可逆的損害,基本應(yīng)在10 次以內(nèi), 每組電穿孔時(shí)間應(yīng)在20～100msec 。 能量的測(cè)算 電穿孔過程中能量的測(cè)算公式為: Q(J ) = V2 TP412R 其中Q 代表電穿孔時(shí)導(dǎo)入的能量,V 代表施加的電壓,T 代表電穿孔延續(xù)的時(shí)間,R 代表作用組織的電阻。試驗(yàn)證明在導(dǎo)入能量一定的情況下外源基因轉(zhuǎn)移效率也相近。在此原則基礎(chǔ)上可根據(jù)不同的組織器官選擇不同的電壓和電穿孔時(shí)間。 溫 度 由于電穿孔瞬間在局部會(huì)產(chǎn)生大量熱,因此操作過程中,DNA 轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)保持4 ℃,同時(shí)電穿孔操作部位的溫度也應(yīng)適當(dāng)降低,Muramatsu 證明溫度較低的情況下,外源基因的轉(zhuǎn)移表達(dá)效率會(huì)有明顯的提高。此外在電穿孔操作部位溫度降低的同時(shí)可以有效抑制局部組織的出血和外源DNA 的流失,這樣也在一定程度上保證了基因的導(dǎo)入效率。 DNA 的狀態(tài)和濃度 很多試驗(yàn)都證明線狀DNA 較環(huán)狀DNA 在活體電穿孔法瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的建立中效果較好［12 ］ 。DNA 的濃度應(yīng)在1～40mgPml 范圍內(nèi)。 DNA 溶液組分 DNA溶液中不應(yīng)含有不能分解成離子的組分,如甘露糖醇、蔗糖等。這些大分子存在時(shí)會(huì)降低基因的轉(zhuǎn)移效率。 5、活體電穿孔法在不同組織上的應(yīng)用 肌肉組織 在肌肉組織中最初進(jìn)行外源基因活體導(dǎo)入是采用電穿孔法。選擇肌肉組織作為靶組織是因?yàn)榧∪饨M織在體內(nèi)所占比例很大,約占40 % ,而且外源基因可在肌肉中長期表達(dá)、分泌,在基因治療中經(jīng)常會(huì)用到。此外,外源基因也不會(huì)因肌細(xì)胞的分裂而丟失。 皮 膚 皮膚組織相對(duì)于其他組織較難進(jìn)行電穿孔法的基因?qū)?因?yàn)槠つw比較薄,電阻相對(duì)低,要求電流較高。但如果電流過大,會(huì)嚴(yán)重影響基因的表達(dá),因此應(yīng)適當(dāng)降低電流和電壓,延長電穿孔的時(shí)間。另外,由于皮膚組織含有的脂肪細(xì)胞分布不均,會(huì)干擾電穿孔的作用,因此只推薦用鑷狀電極,且應(yīng)將動(dòng)物被毛刮凈后操作。雖然外源基因在皮膚中表達(dá)的時(shí)間較肌肉中短,但可利用活體電穿孔法對(duì)很多皮膚疾病進(jìn)行治療。 肝 臟 由于肝臟的生理代謝十分旺盛,因此外源基因在肝臟中的表達(dá)時(shí)間往往很短暫,而且表達(dá)產(chǎn)物的水平也較低。為減少出血,可從小靜脈注入，然后在肝臟上施加電場(chǎng),能顯著增強(qiáng)基因的表達(dá)。 睪 丸 相對(duì)于其他的轉(zhuǎn)基因方法,活體電穿孔法可使外源基因在睪丸中產(chǎn)生大量和持久的表達(dá)。此外,很多研究人員希望利用活體電穿孔法將外源基因?qū)刖? 進(jìn)而通過授精得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。Yamazaki 等［13 ］ 和Ryoki 等［14 ］ 用甲磺酸丁二醇二酯注射或用手術(shù)法將動(dòng)物人為造成隱睪,大部分體細(xì)胞和分化了的精母細(xì)胞減少,這樣使外源基因?qū)刖?xì)胞的幾率增加。Ryoki 等［14 ］ 將基因與病毒誘導(dǎo)的整合酶基因共轉(zhuǎn)染,可在精原細(xì)胞中檢測(cè)到外源基因的表達(dá),且病毒誘導(dǎo)的雙基因共轉(zhuǎn)染較單基因整合效率更高。但目前用這種方法獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還較難。 禽類輸卵管 對(duì)禽類輸卵管活體電穿孔的研究很少,但這一方法卻有很廣闊的發(fā)展前景。因?yàn)檩斅压芟袤w細(xì)胞具有很強(qiáng)的分泌功能,可以將大量蛋白分泌到雞蛋中。也可以利用此瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)檢測(cè)含卵清蛋白啟動(dòng)子的載體功能。Park 等用活體電穿孔法以熒光素基因?qū)腚u輸卵管上皮,檢測(cè)到熒光素活性約4500RLUPmg 組織［15 ］ 。 眼睛、胚胎和禽類胚盤 這三種組織都是很脆弱的,如果實(shí)施基因槍法,會(huì)使靶組織因強(qiáng)烈的機(jī)械損傷而失去功能或直接導(dǎo)致發(fā)育停滯。Sakamoto 將血纖蛋白溶酶原激活因子基因?qū)胙劬χ?有效抑制了眼睛在淤傷后血纖蛋白的反應(yīng)。哺乳動(dòng)物胚胎的電穿孔操作包括離體和子宮內(nèi)操作。禽類胚胎基本是在蛋殼中進(jìn)行電穿孔的,而且表達(dá)快速,Momose 等報(bào)道電穿孔施加后215 小時(shí)在雞胚中就可以檢測(cè)到外源基因的表達(dá),這在使用病毒載體時(shí)也是不可能的。當(dāng)電場(chǎng)被限定在一個(gè)很小的范圍內(nèi)時(shí),基因可以定點(diǎn)表達(dá), 這是活體電穿孔法的又一優(yōu)點(diǎn),Katahira 等［17 ］ 證實(shí)可將外源基因?qū)腚u胚大腦、心臟和一些微小組織(如中胚層,間充質(zhì)和體節(jié)) 中進(jìn)行表達(dá)。 6、 活體電穿孔法進(jìn)行基因治療及外源基因表達(dá)的調(diào)控 6．1 活體電穿孔法在基因治療方面的應(yīng)用 原來在基因治療中利用活體電穿孔法將抗體或化療藥物導(dǎo)入腫瘤中,促進(jìn)抗體和化療藥物的運(yùn)送來進(jìn)行治療,現(xiàn)在則以特異的外源基因替代了抗體的應(yīng)用,簡化操作步驟同時(shí)降低了費(fèi)用。 首先,在皮膚瘤和腦瘤的治療中,電穿孔法可有效地將藥物基因?qū)胫委煵课?。電穿孔法?dǎo)入人單核細(xì)胞趨化物蛋白基因到大鼠腦瘤后,該蛋白在腫瘤的局部表達(dá),同時(shí)在基因?qū)氲牟课豢捎^察到巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞的聚集。 同時(shí)有科學(xué)家從另一角度研究電穿孔對(duì)治療腫瘤方面的作用,利用高電場(chǎng)強(qiáng)度的陡脈沖促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生不可逆性電擊穿而最終死亡,這種方法很適于局部組織腫瘤的治療。 此外,活體電穿孔法還可以參與癌癥的治療,通過活體電穿孔法將基因?qū)霗C(jī)體后,導(dǎo)入組織可成為分泌抗體等物質(zhì)的臨時(shí)分泌器官,以抵抗癌細(xì)胞的侵蝕或代償由于癌細(xì)胞的侵蝕而造成的機(jī)體多種生理機(jī)能的喪失。 除了可以利用活體電穿孔法對(duì)腫瘤進(jìn)行局部治療外,還可以治療機(jī)體的內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的疾病?？稍跈C(jī)體局部以活體電穿孔法導(dǎo)入編碼分泌型蛋白的基因,這種重組的治療蛋白可以隨著血液循環(huán)分布到全身各種組織和細(xì)胞進(jìn)行治療。如在活體電穿孔骨骼肌導(dǎo)入EPO 基因后,可通過紅細(xì)胞比容值檢測(cè)到EPO 基因表達(dá)產(chǎn)物的增加。Yasui 等在小鼠體內(nèi)檢測(cè)到活體電穿孔法導(dǎo)入的胃泌素基因的表達(dá)產(chǎn)物和人的單克隆抗體。 在不遠(yuǎn)的將來,研究人員可以選擇機(jī)體的一種組織的某個(gè)位置作為活體電穿孔的靶位點(diǎn),將治療基因從該位點(diǎn)導(dǎo)入進(jìn)而表達(dá),因此又可以把這個(gè)特殊的組織當(dāng)作機(jī)體的一個(gè)人造的內(nèi)分泌或免疫組織,對(duì)病人進(jìn)行相應(yīng)的治療?；铙w電穿孔法可對(duì)系統(tǒng)疾病產(chǎn)生作用并且安全有效。將不同類型的耐藥基因同時(shí)導(dǎo)入造血細(xì)胞,以擴(kuò)大耐藥范圍和進(jìn)行體內(nèi)選擇是基因治療的重要策略,這類載體基因片段大多較長,進(jìn)行傳統(tǒng)基因?qū)胗幸欢ǖ碾y度。有報(bào)道可以用活體電穿孔法將醛脫氫酶基因和多藥耐藥基因共轉(zhuǎn)移并在PA317 細(xì)胞中獲得高效表達(dá),轉(zhuǎn)導(dǎo)率達(dá)98 % ,測(cè)定藥物蛋白表達(dá)較常規(guī)方法增高4 倍。此外電穿孔法有很高的經(jīng)皮促滲作用,可進(jìn)行很多經(jīng)皮給藥的治療。 6．2 基因治療中外源基因表達(dá)的調(diào)控 研究人員大都不希望導(dǎo)入的外源基因過度表達(dá),尤其在基因治療中,我們希望外源基因表達(dá)的誘導(dǎo)和抑制能夠得到控制。目前這方面的研究主要包括兩個(gè)方面:效應(yīng)元件調(diào)節(jié)和生理活動(dòng)調(diào)節(jié)。效應(yīng)元件的作用,例如類固醇類激素誘導(dǎo)的效應(yīng)元件中,在卵清蛋白啟動(dòng)子5′遠(yuǎn)端019kb 處有一個(gè)雌激素效應(yīng)元件,將具有此元件的基因?qū)氤赡昴鸽u后,在其皮下注射糖皮質(zhì)激素和雌激素,便可誘導(dǎo)外源基因的高效表達(dá),表達(dá)量較未經(jīng)激素誘導(dǎo)的對(duì)照組增加10 倍。
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