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lonza 無血清培養(yǎng)基 (點(diǎn)擊標(biāo)題進(jìn)入）
Corning® KBM 581 淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基 (點(diǎn)擊標(biāo)題進(jìn)入）
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摘要：具有腫瘤細(xì)胞反應(yīng)性的嵌合抗原受體（CARs）修飾的過繼T細(xì)胞移植是一個(gè)腫瘤學(xué)新興的領(lǐng)域，在初步的臨床試驗(yàn)中已經(jīng)顯示出驚人的抗腫瘤療效,但仍然有一系列與 CAR-T細(xì)胞有關(guān)的開放問題，比如從其確切的作用機(jī)制（藥效學(xué)），到它們在體內(nèi)持久性（藥代動力學(xué)）的相關(guān)問題，最后，如何再根據(jù)兩者確定其抗腫瘤作用和毒副作用。由于其前所未有的潛在療效和其在接下來幾年內(nèi)可以預(yù)測到的用途，作者在這篇綜述中，總結(jié)了目前與CARs相關(guān)的臨床藥理學(xué)的一些知識。
1.介紹
從上世紀(jì)40年代中期起，到上世紀(jì)90年代，癌癥的治療完全基于傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性藥物。這些藥物由已知的結(jié)構(gòu)構(gòu)成，有定義良好的藥代動力學(xué)（PK）和藥效學(xué)（PD），并且兩者之間有明顯的相關(guān)性。從本世紀(jì)初期開始，由于對癌癥的生物學(xué)更好的理解和新的先進(jìn)技術(shù)的出現(xiàn)，例如組織微陣列技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)，允許對癌癥特異性分子進(jìn)行詳細(xì)的鑒定，使得開始出現(xiàn)了癌癥的靶向治療技術(shù)。這些靶向的目標(biāo)通常包括信號分子，細(xì)胞周期蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和促血管生成因子。這些分子靶標(biāo)的“藥物能力”依靠的是小分子藥物的合理設(shè)計(jì)：A吸收好，D分布廣，M一段時(shí)間后被代謝 ，E成功的排泄，這也是所謂的ADME 標(biāo)準(zhǔn)。然而，為了有更好的療效，候選小分子的ADME 標(biāo)準(zhǔn)在藥理活性濃度下必須有一個(gè)可以接受的毒性范圍。雖然沒有被列為靶向治療，單克隆抗體（mAb）屬于同一個(gè)概念，取決于它們是否“裸露”，增強(qiáng)能力的或者與強(qiáng)化學(xué)藥物、放射性同位素共軛等。
將免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞進(jìn)行體外加工，輸入癌癥患者體內(nèi)進(jìn)行治療的想法，也就是所謂的過繼細(xì)胞治療（ACT），這個(gè)想法可以追溯到上世紀(jì)80年代中期，在首例靶向治療即史提夫羅森伯格首創(chuàng)的淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞對抗轉(zhuǎn)移性黑色素瘤出現(xiàn)前10年就有了。在三十年內(nèi)，過繼細(xì)胞治療（ACT）的概念急劇變化，現(xiàn)在包括了與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）完全不同的免疫效應(yīng)器，如腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞或者TILs（從腫瘤組織中分離T細(xì)胞，擴(kuò)增并且回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)），而且最近，出現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因表達(dá)克隆的T細(xì)胞受體（TCR）或T細(xì)胞嵌合抗原受體（CAR-T）。最初的設(shè)想是由以色列免疫學(xué)家Zelig Eshhar發(fā)起的，CARs是通常由靶向腫瘤抗原的可變單鏈片段(scFv)，個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)或多個(gè)含有免疫受體酪氨酸活化基序（ITAMs）的細(xì)胞內(nèi)信號分子構(gòu)成。至于CAR的改裝，原先使用的是病毒載體，但是最近也有使用非病毒載體系統(tǒng)。ACT靶向治療和單抗依賴效應(yīng)T細(xì)胞的性質(zhì)，CAR-T被賦予了無與倫比的效力，能夠廣泛的分布和持續(xù)性的存在，且可以獨(dú)立于HLA的存在而識別腫瘤抗原，可有效避免因腫瘤細(xì)胞下調(diào)MHC分子引起的腫瘤逃逸。
考慮到過繼細(xì)胞治療（ACT）的復(fù)雜性，利用傳統(tǒng)的書本中的藥理學(xué)相關(guān)的ADME, PK 和PD概念，已經(jīng)不能用于描述這種新的“有生命”的藥物的相關(guān)情況。然而，自從健康專業(yè)人員、病人和相關(guān)的工業(yè)受益相關(guān)者開始逐漸增加對這種技術(shù)的關(guān)注，它獨(dú)特的藥理學(xué)評價(jià)已經(jīng)備受矚目。這篇文章的目的是簡要的展開對ACT技術(shù)的PK和PD方面的研究，尤其是CAR-T細(xì)胞的研究，集中相關(guān)信息來關(guān)注它運(yùn)作的機(jī)制，特別是在抗腫瘤過程中的作用。
2.CAR-T的藥效學(xué)研究
2.1細(xì)胞內(nèi)信號域的作用
目前所采用的最廣泛的用于CAR介導(dǎo)識別的ITAM包含分子是TCR復(fù)合物的CD3zeta鏈。雖然CARs的細(xì)胞內(nèi)信號scFv序列通過磷脂雙分子層的機(jī)制還沒有被闡明，但結(jié)構(gòu)上的線索暗示了其信號途徑明顯區(qū)別于其它內(nèi)源性的TCR。我們也知道在CAR介導(dǎo)的識別中， TCR引導(dǎo)的下游生理信號也有發(fā)生，包含酪氨酸磷酸化CD3 zeta 鏈、ZAP-70、MAPK的啟動和NFAT的活化過程。
基于相關(guān)模型已經(jīng)證實(shí) TCR 是一種不同于MHC限制的抗原識別，經(jīng)歷構(gòu)象變化，允許與CD3復(fù)合物產(chǎn)生非公價(jià)健相互作用。相反，最近提出一種理論，在CARs中，內(nèi)源性CD3的磷酸化是由于嵌合分子的抗原介導(dǎo)的聚集，src激酶的多分子聚集。(Fig. 1). 有效的CARs介導(dǎo)的信號傳遞確實(shí)需要嵌合分子的物理的接觸和內(nèi)源性TCR復(fù)合物的相互接觸。這一事實(shí)在CD3 zeta鏈條跨膜結(jié)構(gòu)域的突變中可顯著降低CAR同型多聚體和其他TCR復(fù)合物間的非離子共價(jià)鍵。盡管如此，ITAM缺陷的CARs在一定程度上能夠傳導(dǎo)信號，ITAMs的靶向缺失不會導(dǎo)致信號傳遞，說明CARs和內(nèi)源性CD3之間形成的膜近端復(fù)合物，通過鏈間磷酸化，扮演了一個(gè)非常重要的角色。因此，跨膜 L9 殘留物的選擇性突變，對于細(xì)胞表面CAR的聚集至關(guān)重要，會嚴(yán)重消弱信號。最近的證據(jù)說明，在T細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，CARs可能有一個(gè)內(nèi)在的傾向來補(bǔ)充信號，會導(dǎo)致過早的耗盡。
雖然理論上能夠從多種來源設(shè)計(jì)CARs(Fab片段，天然配體，肽，核酸適配體)，但是大多數(shù)CARs的研究是來源于小鼠單克隆抗體單鏈抗體的scFV片段。小鼠單克隆抗體確實(shí)具有高親和力，這是決定其抗腫瘤活性的主要因素之一。其他關(guān)鍵因素是靶向抗原具有足夠高的表達(dá)以及抗原決定簇的暴露。CAR整體的親和性、抗原表達(dá)水平和抗原決定簇的暴露之間的最佳組合決定每個(gè)獨(dú)立靶標(biāo)的獨(dú)特性。例如在自然殺傷T細(xì)胞，TCR信號通過小規(guī)模的TCR/多肽-MHC復(fù)合物得以保證，產(chǎn)生了對它們的物理隔離以及對酪氨酸磷酸酶抑制作用的保護(hù)。表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面的分子數(shù)量以及用于CAR識別的分子，差異很大，而且它們比用于TCR結(jié)合的多肽-MHC分子更加多樣化。因此，構(gòu)建的CARs的ScFv片段的親和性是它們抗腫瘤活性的主要決定因素之一，表現(xiàn)在異種移植小鼠模型的ROR1靶向抗原（Ig）樣/卷曲區(qū)域。此外，CAR親和性的仔細(xì)調(diào)節(jié)也已經(jīng)在倡導(dǎo)中，這作為一種方式來減少在正常組織上低密度靶向抗原帶來的潛在的毒性，例如表皮生長因子受體。
2.2. CAR設(shè)計(jì)扮演的角色
2.2.1 空間間隔的作用
CARs的細(xì)胞內(nèi)部分直接或間接的連接到細(xì)胞內(nèi)信號部分，這樣有足夠的靈活性來接觸不容易接觸的抗原決定簇。例如，膜遠(yuǎn)端的抗原決定簇：CEA上的MFE23，在細(xì)胞外間隔區(qū)存在的前提下，能夠得以優(yōu)化，而膜表面近端的抗原決定簇，例如NACM上的D29，一般需要更長的空間間隔。CARs空間間隔的例子包括了Igs的CH2CH3 Fc部分或者CD4/CD8的Igs樣的細(xì)胞內(nèi)部分。體內(nèi)數(shù)據(jù)表明，攜帶IgG1衍生的CH2CH3 空間間隔的CAR-T細(xì)胞可能會與先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞）相互作用，無視他們的抗原特異性，最終造成不利影響。此外，相同的間隔已被證明有助于激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（AICD）和異種移植模型中CAR-T細(xì)胞過早的清除。雖然從人類進(jìn)行的研究到目前為止，沒有證據(jù)表明這些現(xiàn)象可能會導(dǎo)致降低CAR-T細(xì)胞的功能，或引起不良事件，但這種偶然性需要在將來的發(fā)展中放在思考中。
2.2.2共刺激域的作用
進(jìn)入臨床研究的第一個(gè)CARs，現(xiàn)在被稱為第一代（1G）CAR，通過腫瘤活化小鼠的scFv片段鏈接到TCR CD3 zeta鏈上，這種設(shè)計(jì)，至少在體外，會有潛在的細(xì)胞毒性。然而在病人體內(nèi)，1G CARs修飾的T細(xì)胞的抗腫瘤活性一般不完整，這很可能是由于它們在體內(nèi)的持久性差。雖然小鼠的scFvs的免疫原性可能在這些實(shí)驗(yàn)中對CAR T細(xì)胞的清除作用扮演了重要的角色，很快人們意識到最主要的限制持久性的原因是1G設(shè)計(jì)提供的信號不好。在這個(gè)領(lǐng)域內(nèi)，一個(gè)主要的進(jìn)步就是研究者開始將CD28，4-1BB共刺激域加入嵌合分子中，來提高信號的強(qiáng)度。這就引發(fā)了一個(gè)廣泛的爭論：哪一種胞內(nèi)信號最適合腫瘤殺傷能力。 與TCR介導(dǎo)的信號一起，T細(xì)胞的共刺激因子CD28和抗原提呈細(xì)胞（APCs）B7-1 (CD80) 、 B7-2 (CD86)的相互作用會積極影響T細(xì)胞的許多生物學(xué)方面，包括但不僅僅限于抗凋亡蛋白的誘導(dǎo)，T細(xì)胞的增殖和分化所必須的生長因子活性的轉(zhuǎn)錄/翻譯。
2G CARs的CD28 內(nèi)域通常包含了YMNM基本結(jié)構(gòu)絡(luò)氨酸170，這是已知的重要的Src同源2（SH2）結(jié)構(gòu)域蛋白，例如PI3K和/或適配器Grb2，并通過兩個(gè)富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)激活NFκB（圖2）。此外，Y170本身通過mTOR誘導(dǎo)Bcl-xl，同時(shí)Y170和N172通過PKC-θ增加IL-2的轉(zhuǎn)錄。重要的是，IL-2的轉(zhuǎn)錄階段，即y170和PI3K依賴的轉(zhuǎn)錄起始和PI3K獨(dú)立穩(wěn)定的IL-2轉(zhuǎn)錄，似乎是由2G CARs的CD28細(xì)胞內(nèi)域支持的。這些也包含兩個(gè)富含脯氨酸的基序結(jié)合其他SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白，如Lck，CD28信號連接的共受體CD4／CD8。與1G的CARs相比，CD28為基礎(chǔ)的CARs具有增強(qiáng)的細(xì)胞因子產(chǎn)生和增殖潛能，在異種移植模型中得到了更好的抗腫瘤活性。
在初始TCR /肽–MHC和CD28的信號下，在T細(xì)胞和APC細(xì)胞上，一些額外的受體-配體對會分別上調(diào)。在與配體產(chǎn)生相互作用后，腫瘤壞死因子（TNF）受體家族的成員，如4-1BB，OX40和CD27，特別似乎對維持T細(xì)胞的活化絡(luò)合物是至關(guān)重要的(Fig. 2)。在體外，4-1BB信號已被證明能促進(jìn)Th1和Tc1極化，防止AICD獨(dú)立于CD28，而在體內(nèi)，眾所周知的在原發(fā)性和繼發(fā)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮非冗余的作用。腫瘤壞死因子受體家族的其他成員，除了4-1BB不具有內(nèi)在的激酶活性，但需要結(jié)合TRAF2。因此，4-1BB信號重要的下游效應(yīng)是NF-κB和MAPK p38和JNK。在異種移植模型的研究結(jié)果表明，至少在靶向CD19的CARs中，以1-BB為基礎(chǔ)的CARs修飾的T細(xì)胞與CD28 為基礎(chǔ)的CARs修飾的T細(xì)胞相比，可能具有更好的抗腫瘤活性。盡管如此，在一些存在很多變量的臨床試驗(yàn)中（Tab1），至少是暫時(shí)的，4-1BBCARs的設(shè)計(jì)會輕易的以絕對優(yōu)勢超過CD28。
雖然尚未用于臨床研究，其他共刺激分子以證明可以改善CAR介導(dǎo)的信號，包括那些來自O(shè)X40和ICOS CD27的共刺激信號分子。與4-1BB、OX40依賴于TRAF2進(jìn)行活化一樣，能有效獨(dú)立激活NFkB。因此，3G的CARs結(jié)合了OX40和CD28內(nèi)域，與其他CARs相比，展示了對NFkB的協(xié)同活化作用。此外，OX40介導(dǎo)的3G CARs的共同信號已經(jīng)結(jié)合了一個(gè)CD28內(nèi)域，已經(jīng)被證明能夠有效的抑制IL-10的分泌信號，不會干擾細(xì)胞毒性和促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。CD27是腫瘤壞死因子受體家族的另一成員，在促進(jìn)T細(xì)胞存活和免疫記憶中扮演了重要的角色。在異種移植模型，以CD27為基礎(chǔ)的CARs修飾的T細(xì)胞與4-1BB為基礎(chǔ)的CARs修飾的T細(xì)胞相比，具有增強(qiáng)持久性和抗腫瘤活性，但是優(yōu)于那些以CD28為基礎(chǔ)的CARs修飾的T細(xì)胞。相反的，CD28為基礎(chǔ)的CARs和以CD27為基礎(chǔ)的CARs，似乎不能介導(dǎo)IL-2的產(chǎn)生，也可能會抑制潛在的免疫調(diào)節(jié)。最新的一個(gè)CAR共刺激結(jié)構(gòu)家族的來自于ICOS。與4-1BB 和OX40不同，ICOS屬于CD28家族，已經(jīng)被證明對于人類Th17細(xì)胞的擴(kuò)增和功能尤其重要。
2.3 不同于α-β T淋巴細(xì)胞的效應(yīng)者
迄今為止，大多數(shù)研究CARs的研究都集中在對傳統(tǒng)的α-β-T細(xì)胞的關(guān)注。然而，其他淋巴細(xì)胞亞群，如自然殺傷細(xì)胞（NK），iNKT細(xì)胞，γδT細(xì)胞和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）細(xì)胞，可能會優(yōu)于α-β T淋巴細(xì)胞。
雖然CAR可獨(dú)立于HLA識別腫瘤細(xì)胞，因此也不需要病人和T細(xì)胞之間進(jìn)行HLA配對，但有肯能導(dǎo)致由TCR引起的移植物抗宿主病。由于TCR陰性表達(dá)，NK細(xì)胞是一種有價(jià)值的可替代αβT細(xì)胞的細(xì)胞，因?yàn)樗麄兛梢詮牟煌琀LA的捐助者那里獲得，將CARs輸入患者不會引起同種異體的免疫反應(yīng)。此外，與同種異體NK細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移的臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明，這些細(xì)胞在體內(nèi)能存活幾個(gè)星期甚至個(gè)把月。重要的是，NK-92細(xì)胞和NK細(xì)胞研究表明，當(dāng)整合了CARs，其表現(xiàn)比CD3 zeta更好。雖然NKT細(xì)胞非常稀少（循環(huán)T細(xì)胞的0.1%），但由于由于其低毒性（CD1d表達(dá)僅限于APCs）和其標(biāo)記腫瘤趨向性，自然殺傷T細(xì)胞（NKT）是CARs研究另一個(gè)有前景的細(xì)胞類型?；谶@些假設(shè)，iNKT細(xì)胞介導(dǎo)結(jié)合了CD28和4-1BB內(nèi)域的3G CARs，已被證明是能夠有效的抗腫瘤作用，并且在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的小鼠模型中不引起移植物抗宿主病。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）細(xì)胞，可由抗CD3單抗和超生理濃度的IL-2刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞后產(chǎn)生。與iNKT和γδT細(xì)胞一樣，CIK細(xì)胞顯示出抗腫瘤功能，但也顯示了一些微不足道的同種異體反應(yīng)性。有趣的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在3G CARs的過度刺激下，會減少CIK細(xì)胞的抗腫瘤活性，可能是由于加速了最后的分化。
3.CAR-T細(xì)胞的藥代動力學(xué)
與傳統(tǒng)藥物不同，吸附、分配、代謝和排泄（ADME）的藥理學(xué)概念，不能用于模型中的CAR-T細(xì)胞的藥代動力學(xué)。由于這些細(xì)胞通常是靜脈注射，吸附顯然不是問題。相反，分布，代謝和排泄也適用，但需要徹底反思。類似于天然T細(xì)胞，我們假定CAR-T細(xì)胞廣泛分布于組織中，發(fā)揮其抗腫瘤作用后，通過一個(gè)所知甚少的機(jī)制得以消除。從理論上講，CAR-T細(xì)胞死亡是由于缺乏生存的因素或通過脾臟和肝臟中的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的循環(huán)得以清除。
3.1體內(nèi)的生物分布
CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性的先決條件是它們的特異性的遷移能力和在腫瘤部位保持全部的效應(yīng)功能。廣泛的認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞尤其是上皮起源的腫瘤細(xì)胞，會強(qiáng)烈的改變腫瘤部位的微環(huán)境，對進(jìn)入的T細(xì)胞保持?jǐn)骋狻Ｒ虼?，到目前為止，最好的臨床試驗(yàn)結(jié)果都是在血液腫瘤中獲得，這是因?yàn)榕c其他實(shí)體腫瘤相比，血液腫瘤有更能接觸到T細(xì)胞，具有更少的免疫抑制的微環(huán)境。雖然早期的1G CARs不能證明CAR-T細(xì)胞在腫瘤部位有明顯的聚集，但是最近2G CAR-T的試驗(yàn)，已經(jīng)能夠在血液腫瘤和非血液腫瘤消減的腫瘤部位發(fā)現(xiàn)有CAR-T細(xì)胞的聚集，這就說明有效的遷移是抗腫瘤的一個(gè)關(guān)鍵性因素。事實(shí)上，CAR-T細(xì)胞富集至腫瘤部位涉及一系列復(fù)雜的過程：開始是T細(xì)胞的粘附，接下來是內(nèi)皮細(xì)胞通過趨化因子的滲透進(jìn)入到抗原豐富的區(qū)域。在這個(gè)過程中，T細(xì)胞積極的降解內(nèi)皮下基底膜的主要成分和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）。最近證明CAR-T細(xì)胞對于實(shí)體腫瘤的滲透性差，這可能，至少部分是由于ECM降解酶的下調(diào)。因此，轉(zhuǎn)染了乙酰肝素酶編碼基因的CAR-T細(xì)胞大幅增加了對實(shí)體腫瘤的滲透，在異種移植小鼠模型中的活性很好。此外，CAR-T細(xì)胞在腫瘤中的積累會暫時(shí)的升高衰竭的標(biāo)記物，可逆的失去它們的功能，如最近的一個(gè)小鼠間皮瘤的模型中已發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。由于TGF-β是一個(gè)在實(shí)體腫瘤的微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的主要的免疫抑制因子，研究者已經(jīng)提出通過敲出T細(xì)胞TGF-β受體，使它們對這種細(xì)胞因子的影響不再敏感。
3.2 內(nèi)在因素的作用
3.2.1記憶分化表型的作用
一般認(rèn)為決定過繼T細(xì)胞移植的持續(xù)性的關(guān)鍵因素是它們培養(yǎng)結(jié)束后，輸入患者前的記憶分化狀態(tài)。根據(jù)最近修訂的記憶T細(xì)胞分化的線性模式，可以確定的是增加抗原刺激水平，能夠使得自然T細(xì)胞變成干細(xì)胞記憶T細(xì)胞(TSCM), 然后變成中央記憶T細(xì)胞(TCM)，并且最后變成效應(yīng)記憶T細(xì)胞（TEM）細(xì)胞。然而在體外，在效應(yīng)功能方面，效應(yīng)記憶T細(xì)胞（TEM）細(xì)胞優(yōu)于中央記憶T細(xì)胞(TCM)，在小鼠模型內(nèi)，TCM細(xì)胞展現(xiàn)出了更好的治療效果，可能是由于它與TEM 細(xì)胞相比，具有更好的持久性。TCM來源的抗原特異性T細(xì)胞的持續(xù)性存在，可能是哺乳動物的共同特征，這在非靈長類動物中得到確認(rèn)。在近幾年臨床使用過程中出現(xiàn)的T細(xì)胞的體外操作，已經(jīng)被證明是會逐漸分化為TEM型，并導(dǎo)致功能上的變化，使它們更少的“適合”抗腫瘤反應(yīng)。臨床試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行了回顧性的分析確實(shí)表明體內(nèi)CAR-T細(xì)胞長期持久性（高達(dá)192周）與TCM細(xì)胞和 TSCM細(xì)胞在注入產(chǎn)品中的比例密切相關(guān)。另一個(gè)試驗(yàn)中，靶向CD19 CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的持續(xù)性存在（長達(dá)6個(gè)月），這與它們TCM表型以及CCR7和CD127的表達(dá)以及CD27和PD-1的缺失有關(guān)。這些數(shù)據(jù)支持一種假設(shè)，即體外操作，專門為保護(hù)一個(gè)早期分化表型的設(shè)計(jì)可能會增強(qiáng)抗腫瘤效果。
3.2.2 共刺激內(nèi)域的作用
雖然認(rèn)為最新一代的CAR-T設(shè)計(jì)的引入是最新臨床試驗(yàn)成功的主要決定因素。我們尚不清楚是否有其他特別的共刺激域能夠增加CAR-T細(xì)胞的持久性。值得注意的是，4-1BB與CD28相比，在體外展現(xiàn)了更好的持久性，在小鼠模型內(nèi)，靶向CD19 CAR-T細(xì)胞具有更好的持久性。在臨床試驗(yàn)中，整合了CD28內(nèi)域的靶向CD19 CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的存活時(shí)間限制在大約30天之內(nèi)。這些試驗(yàn)，由于疾病種類、腫瘤負(fù)擔(dān)、調(diào)節(jié)方案、病毒載體類型和細(xì)胞劑量的變化，對于結(jié)果的分析也是一個(gè)非常大的挑戰(zhàn)。（Table 1）
3.2.3 提高在體內(nèi)的持續(xù)時(shí)間
為了成功利用ACT，第一個(gè)需要滿足的是足夠的臨床級別數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞。這個(gè)目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)隨著活化信號、培養(yǎng)條件和用于轉(zhuǎn)染的病毒種類的變化而明顯變化。第一個(gè)用于癌癥治療的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的擴(kuò)增方案由史提夫羅森伯格集團(tuán)描述的，依靠靶向CD-3單克隆抗體（OKT3）活化，并且在飼養(yǎng)層細(xì)胞和高濃度的IL-2中進(jìn)行培養(yǎng)的方案。
在此同時(shí)，用ACT治療病毒性疾病的研究被建議用靶向CD28單抗共刺激來培養(yǎng)細(xì)胞。CD28單抗處理能夠獲得大量的淋巴細(xì)胞，同時(shí)保持較高的TCR-beta，這可能是因?yàn)樵诩?xì)胞循環(huán)中有強(qiáng)烈的信號聚集TNA。隨后，伴有抗CD3和CD28單抗的磁珠（CD3/CD28珠）作為有效的工具來體外擴(kuò)增病人來源的T細(xì)胞，在異基因移植之后增加抗腫瘤活性。相同的方法也用于基因修飾的T細(xì)胞，保護(hù)TCM表型和在臨床前模型中保持持久性。另一個(gè)活躍的研究領(lǐng)域是在體外培養(yǎng)的過程中涉及到細(xì)胞因子的需求，能夠保護(hù)早期的記憶分化表型。有一些研究發(fā)現(xiàn)，盡管IL-2是一種種有效的T細(xì)胞生長因子，但也存在這不良影響，如促進(jìn)終末端分化、AICD等。此外，IL-2也與CD4+/CD25+/FoxP3+自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生產(chǎn)和功能活化有關(guān)聯(lián)。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)IL-7和IL-15對于人同種異基因修飾的T細(xì)胞擴(kuò)增是必須的，并且在小鼠體內(nèi)會導(dǎo)致GVHD和移植物抗白血病（GVL）。異種移植小鼠模型體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，確實(shí)需要相同的細(xì)胞因子來保證早期分化細(xì)胞的表型的CAR-T細(xì)胞的生產(chǎn)，能夠展現(xiàn)最優(yōu)的抗腫瘤作用。TSCM選擇性擴(kuò)增的替代方法也在評估之中。Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的操作是一個(gè)可能的方向，盡管事實(shí)上，β-連環(huán)蛋白積累會導(dǎo)致減少的T細(xì)胞增殖和阻滯分化。
3.3.1 宿主條件扮演的角色
淋巴細(xì)胞減少的狀態(tài)能夠增強(qiáng)過繼移植T細(xì)胞的抗腫瘤活性的概念已經(jīng)確定了超過35年了，早在1980年，就發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)患者之前接受過胸腺切除術(shù)和放療后，腫瘤致敏的T細(xì)胞的過繼移植是有效的。在黑色素瘤的一個(gè)臨床試驗(yàn)中，通過氟達(dá)拉濱和環(huán)磷酰胺處理的免疫抑制環(huán)境，再接受TILs細(xì)胞的過繼移植，會產(chǎn)生50%的有效率和較好的持久性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果有歸結(jié)出了后來的淋巴細(xì)胞缺失提高了腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞抗腫瘤活性的機(jī)理。因此，去除T細(xì)胞的同種異體移植后，淋巴細(xì)胞減少的狀態(tài)已被證明可以提供大量的IL-7和IL-15，這又反過來促進(jìn)了TCM和TSCM的擴(kuò)增。
有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，記憶T細(xì)胞可以缺乏抗原刺激的情況下，能夠依靠IL-7存活。在黑色素瘤患者的ACT試驗(yàn)中，雖然在注射前TIL上的IL-7 表達(dá)很低，但在體內(nèi)能夠觀察到大規(guī)模的上調(diào)，這說明了IL-7信號和長期持久性之間的因果關(guān)系。通過類推，在異種移植小鼠模型，同種異體自殺基因修飾的T細(xì)胞的自我更新潛能與IL-7的表達(dá)是密切相關(guān)的。在大多數(shù)的CAR-T細(xì)胞試驗(yàn)中，淋巴細(xì)胞清除是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的操作來確?；蛐揎桾細(xì)胞功能的增強(qiáng)，至少在自體移植中（Table 1）
3.3.2 抗轉(zhuǎn)基因免疫應(yīng)答的作用
大多數(shù)臨床研究使用的CARs是鼠源性單抗的scFv為基礎(chǔ)，需要考慮宿主免疫系統(tǒng)的排斥反應(yīng)，包括體液免疫和細(xì)胞免疫。此外，由于CARs是生物制品，不同蛋白質(zhì)之間區(qū)域很可能會產(chǎn)生新的免疫原性肽。在一個(gè)早期的臨床研究中， 惡性淋巴腫瘤患者輸入的CAR-T細(xì)胞表達(dá)了在體外篩選所需的抗性基因，以至于CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)檢測到的時(shí)間非常短（24h-7d），而且能夠檢測到輸入產(chǎn)品的細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng)。更詳細(xì)的分析表明，這些反應(yīng)是針對抗性基因，而不是對CARs的結(jié)構(gòu)。在非人類靈長類動物模型中，能夠檢測到對抗嚙齒動物scFv CAR成份的細(xì)胞免疫反應(yīng)。這說明存在著使用非人類scFv的異種免疫障礙。因此，在最近的臨床試驗(yàn)中，對抗自體的靶向CD19 CAR-T細(xì)胞的T細(xì)胞增殖反應(yīng)在一些病人中發(fā)現(xiàn)，但是似乎不會影響抗白血病的能力。
4.靶向CD-19 CAR-T細(xì)胞的臨床結(jié)果
到目前為止，研究的最多的靶標(biāo)是CD19，B細(xì)胞惡性淋巴瘤是第一種使用CAR-T治療的癌癥。早期的CD19 CAR-T的研究結(jié)果對于其他一些疾病的治療也提供了證據(jù)上的幫助，例如慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)和急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)。
4.1抗腫瘤效果
4.1.1慢性淋巴細(xì)胞白血病的治療結(jié)果
在2011年，賓夕法尼亞大學(xué)的研究組報(bào)道了一個(gè)初步但卻是驚人的一個(gè)臨床結(jié)果，使用CD-19 CAR-T細(xì)胞治療三位CLL患者中，有兩位患者有完全的緩解。在這些初始的病人中，融合了4-1BB內(nèi)域的靶向CD19 CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)能夠快速的擴(kuò)增，消除高腫瘤負(fù)擔(dān)，堅(jiān)持了三年沒有喪失功能。從此，在腫瘤免疫治療過程中，CAR-T細(xì)胞通常被稱為“連環(huán)殺手”，因?yàn)橥ㄟ^換算，1個(gè)CAR-T細(xì)胞能夠殺死多達(dá)1000個(gè)腫瘤細(xì)胞，或者被稱為“大殺手”因?yàn)樗梢韵蟮哪[瘤聚集。最近，在同一個(gè)研究組中的14個(gè)病人數(shù)據(jù)，鞏固了這些令人激動的結(jié)果，4個(gè)持續(xù)的CRS和4個(gè)部分的部分緩解（PRS），總有效率達(dá)到了57%。于此同時(shí)，結(jié)合了CD28的靶向CD19 CAR-T細(xì)胞治療在斯隆-凱特琳癌癥中心（MSKCC）和國家癌癥研究所（NCI）觀察到了類似的結(jié)果。忽略這三個(gè)臨床研究中CAR-T細(xì)胞的差異，值得強(qiáng)調(diào)的是每個(gè)病人的抗腫瘤效果是于CAR-T細(xì)胞持久性是有直接關(guān)聯(lián)的，再一次強(qiáng)調(diào)了PK在決定抗腫瘤效果中的作用。
4.1.2 急性淋巴細(xì)胞白血病的療效
同一個(gè)研究組進(jìn)行更大規(guī)模的研究，結(jié)果比得到的CLL結(jié)果有更令人印象深刻。這組包括了30名患有復(fù)發(fā)性/難治性兒童和成人ALL患者。這個(gè)結(jié)果報(bào)道了90%的完全緩解率，CAR-T注射后進(jìn)展的臨床有效性能夠長達(dá)4年。MSKCC的研究組研究了16位成人ALL患者，CR達(dá)88%。在另一個(gè)21個(gè)兒童的研究中，NCI的報(bào)道是70%。所有的研究中包含了前期使用異基因造血干細(xì)胞移植的患者，CAR-T細(xì)胞使用均沒有引起GVHD。如果有人想對比CLL的治療，很明顯，ALL病人的通過CAR-T消除腫瘤的動力學(xué)更加迅速，可能是由于不同腫瘤負(fù)擔(dān)免疫負(fù)擔(dān)有關(guān)。雖然在這些試驗(yàn)中，兩個(gè)月時(shí)測量的抗腫瘤能力相差不大，但是更久后的預(yù)后可能會非常不同。參與MSKCC和NCI實(shí)驗(yàn)的大部分CR患者隨后都進(jìn)行了造血干細(xì)胞的移植，而UPenn的患者在完全緩解后未接受進(jìn)一步的治療。導(dǎo)致這種差異的可能原因是研究機(jī)構(gòu)因不同共刺進(jìn)信號選擇后導(dǎo)致的CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)存活時(shí)間差距導(dǎo)致，UPen選擇的4-1BB共刺激信號分子可使CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的存活期超過2年，遠(yuǎn)高于MSKCC使用CD28制備的CAR-T細(xì)胞。
4.2 CAR-T細(xì)胞的毒性
在明確任何治療策略的有效性之前，一些監(jiān)管問題需要認(rèn)真解決，例如確定最小的釋放標(biāo)準(zhǔn)、最大耐受劑量和探索潛在副作用等。ACT產(chǎn)品，有其特殊性。在目前臨床CAR-T發(fā)展的階段，對所有這些問題進(jìn)行徹底的評估當(dāng)然可能。盡管如此，也很顯然的，CAR-T治療會伴有明顯的副作用。例如，在早期的臨床研究中，使用CAR-T細(xì)胞靶向HER2，由于肺臟的毒性，一位病人在輸入細(xì)胞后的5天死亡。這種嚴(yán)重的副反應(yīng)是由于CAR-T細(xì)胞對肺上皮細(xì)胞底水品表達(dá)的HER-2識別造成的。然而，后來的研究表明，靶向HER2 CAR-T在肉瘤的治療中是相對安全的，尤其是在使用早期設(shè)計(jì)的CAR-T細(xì)胞，并使用更謹(jǐn)慎的劑量遞增回輸?shù)姆绞?。鑒于抗CD19 CAR-T細(xì)胞發(fā)展到了較高級階段，審核重點(diǎn)應(yīng)該放在這種實(shí)驗(yàn)的毒性的描述方面。
4.2.1 B細(xì)胞發(fā)育不全
持久的B細(xì)胞發(fā)育不全，以及由此產(chǎn)生的低丙種球蛋白血癥，是CAR-T細(xì)胞治療的首要的和最明顯的毒性。值得注意的是，B細(xì)胞耗竭的程度和它的動力學(xué)現(xiàn)在被認(rèn)為是一個(gè)非常準(zhǔn)確的藥代動力學(xué)。理論上，持續(xù)性的B細(xì)胞發(fā)育不全會增加感染的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)檫@個(gè)原因，靶向CD19 CAR-T細(xì)胞被注入患者后續(xù)預(yù)防性的靜脈注射免疫球蛋白來避免感染的機(jī)會。當(dāng)然，在理想的狀態(tài)下，這將是必要的設(shè)計(jì)策略，達(dá)到理想的抗腫瘤作用后，抗CD19 CAR-T細(xì)胞可清除，允許正常的B細(xì)胞重建。例如，靶向 CD19 CAR-T細(xì)胞可以去除通過共表達(dá)自殺基因，這種方法已經(jīng)在同種異基因造血干細(xì)胞移植后預(yù)防GVHD中進(jìn)行了研究。
4.2.2 細(xì)胞因子釋放綜合征
另一種常見的和潛在的與CAR-T相關(guān)的嚴(yán)重毒性是細(xì)胞因子釋放綜合癥（CRS），臨床并發(fā)癥有高發(fā)熱和低血壓，如果未處理好，會導(dǎo)致多器官功能不全。促炎性細(xì)胞因子的大量生產(chǎn)（IFN-γ、IL-6、TNFα）是CRS產(chǎn)生的關(guān)鍵原因。CRS發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素是在注射時(shí)的高腫瘤負(fù)荷，雖然也有小的腫瘤負(fù)荷者發(fā)生這種并發(fā)癥。早期的嘗試控制CRS包括抗TNF-α單克隆抗體和皮質(zhì)激素。抗TNFα單克隆抗體的使用時(shí)調(diào)節(jié)過度活化造成的不利影響，而不是消減CAR-T細(xì)胞。而通過輸注糖皮質(zhì)激素會導(dǎo)致注入患者循環(huán)的CAR-T細(xì)胞過早消失。與腫瘤壞死因子-α阻斷策略不同，干擾IL-6 利用抗IL-6受體抗體tocilizumab單抗成功地減輕CRS誘導(dǎo)途徑，沒有阻止CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增和潛在的治療作用。這些觀察說明了CRS的病理過程包含三個(gè)不同步驟：1）CAR-T細(xì)胞對目標(biāo)的腫瘤識別，與隨之而來的IFN-γ釋放。2) 單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的活化，從而產(chǎn)生高水平的IL-6。3)IL-6對器官的系統(tǒng)性影響，如肝臟、腦和腎臟。
4.2.3 中樞神經(jīng)系統(tǒng)
中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性(CNS)經(jīng)常在靶向CD19的免疫干預(yù)過程中報(bào)道，即靶向CD3/CD19雙特異性單抗blinatumumab的使用中出現(xiàn)。同樣的，CAR-T細(xì)胞輸注后，急性的和可逆的神經(jīng)毒性已經(jīng)常觀察到，通常會與CRS一起出現(xiàn)，也會在CRS出現(xiàn)后再出現(xiàn)。在最初的美國賓州大學(xué)的試驗(yàn)中，所有患者注射抗CD19 CAR-T細(xì)胞，相當(dāng)一部分（13/30，43%），在CRS發(fā)生的同時(shí)，出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)紊亂（混亂、癲癇發(fā)作、失語、幻覺、譫妄），這個(gè)比例在成人中出現(xiàn)的比例更高。然而，重要的是一部分人(6/30, 20%)，經(jīng)歷了遲發(fā)神經(jīng)毒性，這在后來的臨床試驗(yàn)中也有報(bào)道。這些遲發(fā)神經(jīng)毒性的病理學(xué)過程還是未知的，但是它們的動力學(xué)明顯是與CRS有部分重疊。例如CAR-T細(xì)胞已經(jīng)在患者腦脊液中發(fā)現(xiàn)的，但他們的存在并沒有神經(jīng)毒性相關(guān)性。此外，一些案例分析顯示CAR-T細(xì)胞可滲透進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，出現(xiàn)彌漫性腦病。因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)腦脊液中高濃度的細(xì)胞因子，一些人假設(shè)IL-6在大腦中扮演的角色，但是沒有相對的拮抗藥，因?yàn)閱慰寺】贵w不能穿透血腦屏障。
5.結(jié)論
到目前為止， CAR-T細(xì)胞取得的成果，以及在侵襲性血液腫瘤的治療顯然表明，這種治療方式的潛力，在接下來的幾年內(nèi)，會徹底改變腫瘤的治療方式。不僅僅在血液腫瘤，也希望在實(shí)體腫瘤，可獲得更為穩(wěn)定的臨床數(shù)據(jù)。很明確的是其他的CAR-T的基礎(chǔ)研究是十分急迫的，同樣的，對于這種激動人心的癌癥治療方式，也需要一個(gè)全興的藥理學(xué)新概念。
原文標(biāo)題：Clinical pharmacology of CAR-T cells: Linking cellular pharmacodynamics to pharmacokinetics and antitumor effects
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