將13.5 ml 提取緩沖液(0.1 mol/L磷酸鹽[pH = 8.0 ] ,0.1 mol/L EDTA [pH 8.0 ] ,0.1 mol/L Tris-HCl [pH 8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1.0 % CTAB) 和50μl蛋白酶K(10 g/L ) 與5 g 土壤置于50 ml 的離心管中,放入37 ℃恒溫?fù)u床上,225 r·min - 1振蕩30 min ;
加入1.5 ml20 % SDS ,輕輕混勻,65 ℃水浴加熱2 h ,每隔15～30 min 輕輕搖勻1 次;5 000 r·min - 1離心10 min ,將上清液轉(zhuǎn)入新的50 ml 離心管中;取4.5 ml 提取緩沖液加入原離心管,搖勻泥漿,加入0.5 ml 20 % SDS ,65 ℃水浴15 min ,用上述同樣的離心速度離心10 min ,將上清液與原上清液合并;再重復(fù)此步驟1 次;
用與上清液等量的三氯甲烷于離心管中混勻,5000 r·min - 1離心20 min ;收集上清液,并加入0.6 倍體積的異丙醇,室溫靜置1 h ;25 ℃下12 000 r·min - 1離心20 min ,倒出上清液,干燥后加入500μl 去離子水,溶解粘附于離心管壁的DNA 及其雜質(zhì),并收集于1.5 ml 的微型離心管中.
變性劑加SDS 高鹽法(方案2)
具體步驟：
取1 g 土樣和等量的滅菌石英砂在研缽中混合,加入1 ml 變性劑(4 mol/L異硫青酸胍,10mmol/L Tris-HCl [pH 7.0 ] ,1 mmol/L EDTA[pH 8.0 ] ,0.5 % 2-巰基乙醇) ;液氮冰凍,研磨至溶解,重復(fù)3 次;
轉(zhuǎn)入50 ml 離心管中,加入9 ml 提取緩沖液(0.1 mol/L磷酸鈉[pH 7.0 ] , Tris-HCl [ pH 7.0 ] , 0.1 mol /L EDTA [ pH8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1 %CTAB ,2 %SDS) ;65 ℃水浴1 h ,每10 min 輕輕混勻1 次;5 000 r·min - 1 離心10 min ,取上清;
在原管中加入5 ml 提取緩沖液,混合后,65 ℃水浴10min ,離心,取上清,合入上述上清液;重復(fù)一次;加入等體積的氯仿混合,5 000 r·min - 1離心20 min ,取上清;加入0.6 倍體積的異丙醇,室溫沉淀1 h ;20～25 ℃,12 000 r·min - 1離心20 min ,TE 溶解沉淀.
SDS-酚氯仿抽提法（方案3）
稱取1g土壤樣品，加入1ml 0.1mol/l PH8.0 磷酸緩沖液，玻璃珠振蕩1min。溶菌酶5mg，使終濃度為2.5mg/ml,室溫振蕩15min,放置冰箱30min，加125μl 20%SDS振蕩處理15min，離心，分裝EP管，加酚（1：1體積），抽提1次，氯仿-異戊醇（1：1體積），抽提2次，加0.6體積異丙醇，室溫放置1h,離心，70%乙醇清洗，200μl TE 溶解。
