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一、瓊脂糖凝膠的特點 天然瓊脂(agar)是一種多聚糖,主要由瓊脂糖(agarose,約占80%)及瓊脂膠(agaropectin)組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì),不帶電荷,而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖,由于這些基團(tuán)帶有電荷,在電場作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象,加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。因此,目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳,其優(yōu)點如下。 1. 瓊脂糖凝膠電泳操作簡單,電泳速度快,樣品不需事先處理就可以進(jìn)行電泳。 2. 瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻,含水量大(約占98%~99%),近似自由電泳,樣品擴(kuò)散較自由電流,對樣品吸附極微,因此電泳圖譜清晰,分辨率高,重復(fù)性好。 3. 瓊脂糖透明無紫外吸收,電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。 4. 電泳后區(qū)帶易染色,樣品極易洗脫,便于定量測定。制成干膜可長期保存。 目前,常用瓊脂糖作為電泳支持物,分離蛋白質(zhì)和同工酶。將瓊脂糖電泳與免疫化學(xué)相結(jié)合,發(fā)展成免疫電泳技術(shù),能鑒別其他方法不能鑒別的復(fù)雜體系,由于建立了超微量技術(shù),0.1ug蛋白質(zhì)就可檢出。 瓊脂糖凝膠電泳也常用于分離、鑒定核酸,如DNA鑒定,DNA限制性內(nèi)切核酸酶圖譜制作等。由于這種方法操作方便,設(shè)備簡單,需樣品量少,分辨能力高,已成為基因工程研究中常用實驗方法之一。 二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要是依據(jù)它們的相對分子量質(zhì)量及分子構(gòu)型,同時與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。 1、核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系 ① DNA分子的大小 在凝膠中,DNA片段遷移距離(遷移率)與堿基對的對數(shù)成反比,因此通過已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較,便可測出未知片段的大小。但是當(dāng)DNA分子大小超過20kb時,普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴于分子大小,因此,就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時,分子大小不宜超過此值。 ② 瓊脂脂糖的濃度 如下表所示,不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。
2、核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系 不同構(gòu)型DNA的移動速度次序為:供價閉環(huán)DNA(covalently closed circular,cccDNA)>直線DNA>開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。當(dāng)瓊脂糖濃度太高時,環(huán)狀DNA(一般為球形)不能進(jìn)入膠中,相對遷移率為0(Rm=0),而同等大小的直線雙鏈DNA(剛性棒狀)則可以長軸方向前進(jìn)(Rm>0),由此可見,這三種構(gòu)型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度,但同時,也受到電流強(qiáng)度、緩沖液離子強(qiáng)度等的影響。 3、電泳方法 ① 凝膠類型 用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型(平板型)。水平型電泳時,凝膠板完全浸泡在電極緩沖液下1-2mm,故又稱為潛水式。目前更多用的是后者,因為它制膠和加樣比較方便,電泳槽簡單,易于制作,又可以根據(jù)需要制備不同規(guī)格的凝膠板,節(jié)約凝膠,因而較受歡迎。 ② 緩沖液系統(tǒng) 缺少離子時,電流太小,DNA遷移慢;相反,高離子強(qiáng)度的緩沖液由于電流太大會大量產(chǎn)熱,嚴(yán)重時,會造成膠熔化和DNA的變性。 常用的電泳緩沖液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TEA),Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等,濃度約為50mmol/L(pH7.5~7.8)。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液,臨用時稀釋到所需倍數(shù)。 TAE緩沖能力較低,后兩者有足夠高的緩沖能力,因此更常用。TBE濃溶液長期貯存會出現(xiàn)沉淀,為避免此缺點,室溫下貯存5×溶液,用時稀釋10倍0.5×工作溶液即能提供足夠緩沖能力。 ③ 凝膠的制備 以稀釋的電極緩沖液為溶劑,用沸水浴或微波爐配制一定濃度的溶膠,灌入水平膠框或垂直膠膜,插入梳子,自然冷卻。 ④ 樣品配制與加樣 DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解,緩沖液內(nèi)含有0.25%溴酚藍(lán)或其他指示染料,含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油,以增加其比重,使樣品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結(jié)果產(chǎn)生U形條帶,可改用2.5%Ficoll(聚蔗糖)代替蔗糖或甘油。 ⑤ 電泳 瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實驗條件的研究結(jié)果表明,在低濃度、低電壓下,分離效果較好。在低電壓條件下,線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是,在電場強(qiáng)度增加時,較大的DNA片段遷移率的增加相對較小。因此隨著電壓的增高,電泳分辨率反而下降,為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率,電場強(qiáng)度不宜高于5V/cm。 電泳系統(tǒng)的溫度對于DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響。通常在室溫下進(jìn)行電泳,只有當(dāng)凝膠濃度低于0.5%時,為增加凝膠硬度,可在4℃進(jìn)行電泳。 ⑥ 染色和拍照 常用熒光染料溴乙錠(EB)染色,在紫外光下觀察DNA條帶,用紫外分析儀拍照,或用凝膠成像系統(tǒng)輸出照片,并進(jìn)行有關(guān)的數(shù)據(jù)分析。
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