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          生物資訊

          單細(xì)胞凝膠電泳步驟

          作者:admin 來源:本站 發(fā)布時(shí)間: 2011-03-25 16:56  瀏覽次數(shù):
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          1、分離制備單細(xì)胞懸液:

          (1)體外培養(yǎng)的細(xì)胞株:用胰酶消化,最后用PBS懸浮吹打成單細(xì)胞懸液,細(xì)胞要計(jì)數(shù),具體的量我前邊已經(jīng)說過。

          (2)體內(nèi)臟器細(xì)胞:處死動(dòng)物,取出臟器,于Hanks’液中制備成單個(gè)細(xì)胞懸液。

          2膠板制備:

          (1)取100μl于45℃水浴中保溫的0.5%NMA,鋪于磨沙載玻片上,形成底膠。蓋玻片推勻,不能有氣泡,4度凝固5至8分鐘。

          (2)水平取下蓋片,取100μl于37℃水浴中保溫的0.5%LMA與20μl細(xì)胞懸液(約400個(gè)細(xì)胞)混勻,立即鋪片,加上蓋玻片,4度凝固5至8分鐘。

          3、細(xì)胞裂解與電泳:

          (1)將制備好的膠板去掉蓋玻片后,浸于4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中,在4℃下裂解2.5到3小時(shí)。

          (2)取出膠板,用雙蒸水浸沒漂洗后放入電泳槽中,浸泡在4℃預(yù)冷的電泳液中解旋20分鐘。

          (3)玻片水平放置陽極端附近,4℃電泳20到25分鐘(25V,300mA)??稍陔娪静壑車颖鶋K以保持低溫。

          4、中和與染色:

          (1)電泳結(jié)束,將膠板浸泡于中和液中,每次10分鐘,共中和3次,每次要更換中和液。最后晾干。

          (2)取出膠板,置于染色缸中,在2μg/ml的EB染色液中,暗處染色5到10分鐘。

          (3)蒸餾水漂洗2次,每次5分鐘。

          稍晾干,濾紙吸去多余水分,盡快在熒光顯微鏡下觀察。

          從膠板制備開始到最后都應(yīng)該在暗光下操作。

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